褪黑素对去卵巢大鼠细胞因子水平和RANKL/OPG比值及骨密度的影响

黄成伟 潘翱

重庆市九龙坡区人民医院药剂科，重庆 400051

绝经后骨质疏松症是由于雌激素缺乏导致破骨细胞活性增强和破骨细胞凋亡率降低所致。白细胞介素-17、白细胞介素-6、肿瘤坏死因子-α和干扰素-γ等细胞因子通过促进破骨细胞生成和抑制成骨细胞分化诱导骨丢失，导致骨密度急剧下降[1]。褪黑素(melatonin，MEL)是松果腺分泌的一种神经内分泌激素，具有广泛的作用，包括调节睡眠、抗衰老、抗炎和抗氧化作用[2]。研究[3]表明，褪黑激素缺乏会导致骨吸收增加，这表明它可能对破骨细胞相关的过程有抑制作用。有研究[4]表明血清褪黑素水平与绝经后妇女的I型胶原相关，表明血清褪黑素水平降低与绝经后妇女骨丢失增加有关。然而，褪黑素在骨质疏松症中的作用尚不完全清楚。因此，本研究的目的是研究褪黑素对骨质疏松模型大鼠炎症细胞因子、RANKL/OPG比值的影响，以及褪黑素对骨密度的直接影响。

1 材料和方法

1.1 研究方案

将体重相近的3月龄Sprague-Dawley(SD)雌性大鼠，行双侧卵巢切除(建立雌激素缺乏性骨质疏松症，OVX)或假手术(Sham)。对实验动物按照机构动物伦理委员会(IAEC/87)的指导方针进行操作。将大鼠随机分为4组，每组8只。A：假手术组(Sham组)，B：去卵巢组(OVX组)，C：去卵巢+β-雌二醇治疗组[487.5 μg/(kg·d),OVX+E2组]，D：去卵巢+褪黑素治疗组[50 mg/(kg·d),OVX+MEL组],药物治疗8周。褪黑素的实验剂量根据先前的报告确定[2]。治疗结束后，处死动物，取胫骨进行骨密度(bone mineral density, BMD)测定，对股骨进行细胞因子和基因表达分析。

1.2 方法

1.2.1骨密度检测：使用DXA扫描测定大鼠胫骨骨密度、骨矿含量(BMC，g)、骨密度(BMD，g/cm2)和骨面积(Area，cm2)。将提取的骨骼清除软组织，放入装满水的培养皿中至1 cm深。采用双能X线骨密度仪(DXA)对感兴趣区(ROI)进行骨密度扫描，采用Hological Discovery QDR小动物高分辨率准直仪进行扫描和分析。

1.2.2基因表达分析：使用美国Sigma公司的TRIzol试剂结合PureLink RNA Mini Kit(Invitgen)从股骨近端分离总RNA。纯化的总RNA用DNase I(Sigma)处理，然后按照制造商的说明使用cDNA合成试剂盒(RevertAid TM H减去First Strand cDNA合成试剂盒，美国Fermentas Life Sciences)进行cDNA转化。以合成的cDNA为模板，检测RANK1、OPG、IL-23 A和IL-17 A基因的表达，并与β-肌动蛋白基因表达进行对照。所使用的引物、登记号、产物大小和TM如表1所示。通过SYBR Green方法使用实时PCR对各种基因的基因表达进行相对定量。采用比较CT法计算相对基因表达量。

表1 研究基因核酸引物序列Table 1 Sequence of oligonucleotide primers used for studying genen

1.2.3骨组织肿瘤坏死因子-α和白细胞介素-1β检测：切开股骨近端，称其重量。将其粉碎成粉末，悬浮在PBS(含蛋白酶抑制剂)中。混合物在7 500 r/min、4 °C下离心2 min。收集上清液，参照厂家方案(Ray Biotech用于肿瘤坏死因子-α，PeproTech用于IL-1β)用双抗体夹心ELISA法检测肿瘤坏死因子-α和白细胞介素-1β，蛋白质水平使用联苯胆酸(BCA)法测定。

1.3 统计学分析

数据以均数±标准差表示。采用SPSS 22.0软件进行统计分析。使用单因素方差分析(ANOVA)计算各组数据之间差异，并在两组之间进行Bonferroni分析，P值<0.05表示比较差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 褪黑素对去卵巢大鼠骨密度的影响

去卵巢大鼠骨密度由假手术组的0.094 g/cm2降至0.051 g/cm2。然而，当去卵巢大鼠使用褪黑素时，骨密度增加到0.079 g/cm2。见表2。

表2 褪黑素处理对去卵巢大鼠骨密度的影响Table 2 The effect ofmelatonin treatment on bone mineral density in the ovariectomized animals

2.2 褪黑素对骨质疏松大鼠股骨RANKL/OPG比值的影响

基因表达分析显示，与假手术组相比，去卵巢大鼠股骨中RANKL的表达显著增加(P<0.000 1)，而去卵巢动物经褪黑素和β-雌二醇治疗后，RANKL的表达明显降低(P<0.000 1)，见图1 A。虽然这些治疗对OVX大鼠骨保护素(OPG)的相对基因表达没有显著影响(图1B)，但与OVX组(图1C)相比，治疗组的RANKL/OPG比值显著降低(P<0.001)。

图1 褪黑素和雌二醇对RANKL/OPG比的影响 A：褪黑素和雌二醇治疗组中RANKL基因表达的相对变化；B：褪黑素和雌二醇治疗组中OPG基因表达的相对变化；C：RANKL/OPG比。注：***P<0.001。Fig.1 Effect of Melatonin and estradiol on RANKL/OPG ratio

2.3 褪黑素对骨质疏松模型大鼠股骨IL-23和IL-17家族成员表达水平的影响

褪黑素治疗去卵巢大鼠显示IL-23的表达显著降低(图2 A)。分析治疗组和未治疗组促炎症细胞因子IL-17 A的相关基因表达，结果显示，IL-17 A在去卵巢动物体内的表达增加(图2B)。然而，β-雌二醇和褪黑素治疗能有效降低去卵巢大鼠IL-17 A表达(图2B)。褪黑素处理后IL-17B和IL-17F的表达没有任何变化(图2C、图2D)。

图2 褪黑素和雌二醇对IL-23和IL-17表达的影响注：褪黑素处理组和未处理组中IL23(A)、IL-17 A(B)、IL-17B(C)和IL-17F(D)基因表达的相对变化。Fig.2 The effect of melatonin and estradiol on the expression of IL-23 and IL-17

2.4 褪黑素对白细胞介素-1β和肿瘤坏死因子-α的影响

卵巢切除后，IL-1β和肿瘤坏死因子-α水平明显升高。雌二醇和褪黑素均能显著降低IL-1β和TNF-α(图3 A、图3B)。肿瘤坏死因子-α水平在去卵巢动物体内升高明显升高，褪黑素治疗后则显著降低(P<0.001)。雌二醇对肿瘤坏死因子-α水平没有任何影响(图3B)。

图3 褪黑素和雌二醇治疗对IL-1β和TNF-α水平的影响Fig.3 The effect of melatonin and estradiol on the levels of IL-1βand TNF-α A： IL - 1β；B： TNF-α。

3 讨论

骨质疏松症的特征是由于骨吸收增强而导致骨量减少，骨形成降低。绝经后雌激素缺乏或卵巢切除引起的骨骼改变可以在去卵巢啮齿动物模型中得到很好的研究。雌激素缺乏导致成骨细胞和破骨细胞动力学失衡，导致骨微结构改变。褪黑素主要在黑暗中由松果体分泌，在睡眠、昼夜节律、免疫反应、生殖控制和肿瘤生长抑制中起关键作用[2]。越来越多的证据[2]表明褪黑素对骨骼健康起着有益作用。褪黑素已被证明通过激活细胞外信号调节激酶1/2信号通路促进人骨髓间充质干细胞的成骨分化[5]，更重要的是，褪黑素可以通过抑制核因子κ-轻链-活化B细胞轻链增强器(NF-κB)信号通路来抑制破骨细胞的分化[6]。在松果体切除的动物中，已经观察到BMD的下降和骨微结构的恶化[7]。这些结果显示褪黑素可能对骨质疏松症有治疗效果。

DXA扫描显示去卵巢大鼠骨密度明显降低，提示骨质疏松模型建立成功。去卵巢大鼠使用褪黑素治疗后，胫骨骨密度明显增加。NF-κB受体激活剂是肿瘤坏死因子家族的成员之一，由成骨细胞分泌，促进破骨细胞的形成、分化和活化，导致骨丢失。RANKL与破骨细胞RANK的结合受其可溶性诱饵受体—护骨素(OPG)的调节。它的表达受糖皮质激素、甲状旁腺素和各种细胞因子的调节，如IL-1、IL-6、IL-11和肿瘤坏死因子-α[8]。在本研究中，虽然OPG的表达没有受到影响，但在OVX大鼠中观察到RANKL的表达显著增加，导致RANKL/OPG比值净增加。研究[9]表明，雌激素刺激OPG的产生，在缺乏雌激素的情况下，RANKL是参与破骨细胞形成和随后的骨丢失的主要分子。褪黑素和雌激素治疗可以恢复RANKL水平，与Sham组相似，导致治疗动物RANKL/OPG比值降低。最近的一项研究[10]也观察到了类似的结果，使用抗氧化剂可以降低RANKL的表达，增加了OPG的表达，表明褪黑素对去卵巢大鼠的破骨细胞分化和活性具有预防作用。

IL-17是一种促炎细胞因子，由辅助性T细胞(Th17细胞)在转化生长因子β、IL-6、IL-1β和IL-23的作用下产生。IL-23是IL-12家族的成员，可诱导IL-17的产生。用抗VD3/CH28单抗刺激Th细胞，在IL-23存在下分离出分泌IL-17的Th17细胞。这些细胞在RANKL和M-CSF存在的情况下导致破骨细胞形成[11]。Th17细胞的确切功能在小鼠(IL-17/和IL-23/)上进行的基因敲除研究中或在自身免疫性关节炎中使用抗IL-23抗体进行了描述，表明Th17是治疗骨骼退行性疾病的强大靶点[12]。从这些研究可以得出结论，Th17细胞通过IL-23刺激而增殖，并且在T细胞介导的破骨细胞形成中起着至关重要的作用。卵巢切除后Th17细胞增多，通过产生IL-17刺激破骨细胞生成，导致骨质疏松。IL-17还增加肿瘤坏死因子α、IL-6和RANKL的表达，这些都是由成骨细胞产生的促破骨细胞因子。这些效应被雌二醇治疗逆转[13]。在本研究中观察到去卵巢大鼠IL-17 A的表达水平升高。褪黑素治疗可使去卵巢大鼠细胞因子水平显著降低，提示褪黑素可能通过调节细胞因子IL-17 A起到骨保护作用。然而，与褪黑素治疗的大鼠相比，雌二醇治疗组出现IL-17 A水平下降更为明显。IL-23也显示出与Th17细胞因子相似的结果。

研究表明，IL-1、IL-6、IL-17、TNF-α等促炎细胞因子通过增加破骨细胞数量，增加骨吸收速率，参与绝经后骨质疏松症的发生。IL-1β对骨吸收也有很强的刺激作用。IL-1β上调RANKL的产生，通过调节破骨细胞的分化、激活和存活来增强其活性并刺激破骨细胞的生成，从而导致骨吸收[14]。此外，IL-1β通过增加骨内前列腺素(PGE_2)合成刺激骨吸收，上调RANKL表达，从而调节破骨细胞寿命。肿瘤坏死因子α通过其在骨髓基质细胞和破骨细胞前体细胞上的表达促进骨吸收。肿瘤坏死因子α暴露于基质细胞会导致破骨因子的产生，如RANKL、M-CSF和IL-1[15]。在促炎环境中，这些过程共同增加了破骨细胞的寿命和数量，导致骨吸收增加。IL-1、β与肿瘤坏死因子-α在炎症性破骨细胞形成过程中关系密切。在破骨形成过程中，IL-1α上调了肿瘤坏死因子-β的许多反应，提示完全抑制IL-1β和肿瘤坏死因子-α活性可以完全阻止骨吸收[16]。在本研究中，去卵巢大鼠骨IL-1β和TNF-α显著升高，这可能与去卵巢诱导的氧化应激有关。褪黑素可显著降低骨组织中IL-1β和TNF-α水平。这些结果提示，褪黑素对去卵巢大鼠骨吸收的抑制作用可能与其降低IL-1、β和TNF-α水平有关。

综上，雌激素和褪黑素可调节去卵巢大鼠RANKL/OPG、IL-23和IL-17的表达。褪黑素可显著降低去卵巢动物骨骼中IL-1、β和TNF-α的水平。但是本研究也有其不足之处，体现在研究时间较短以及组别较少，没有进一步和其他抗氧化剂药物比较，后续将进一步研究褪黑素改善骨质疏松症的作用机制。