二甲双胍对去卵巢大鼠骨质疏松症的影响及机制研究

苏姗 杨芸瑞 李红利 王丽婷 甄东户*

1.兰州大学第一临床医学院，甘肃 兰州 730000 2.兰州大学第一医院内分泌科，甘肃 兰州 730000

二甲双胍(metformin, MF)被广泛应用于2型糖尿病、代谢综合征、非酒精性脂肪肝病等以胰岛素抵抗为主的疾病的治疗[1]。随着对MF进一步深入研究，研究者发现MF除具有降糖作用外，还可促进骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)向成骨细胞分化，增加成骨细胞数目，促进骨形成，此外MF通过激活钙调蛋白激酶和转化生长因子活化激酶，抑制RANKL的表达以及破骨细胞的分化，从而发挥骨保护作用[2-3]。但其作用机制错综复杂，目前MF对骨代谢影响的具体机制仍未完全明确。因此本研究以去卵巢大鼠模拟骨质疏松症，以雌二醇为对照，观察MF对去卵巢大鼠骨密度及骨矿含量的影响，并从细胞和分子水平探讨MF可能的骨保护机制，为临床上预防和治疗骨质疏松症提供新思路。

1 材料与方法

1.1 实验动物

3月龄SPF级雌性健康SD大鼠60只，体重200～300 g，适应性喂养1周。

1.2 方法

1.2.1去卵巢大鼠模型的建立及骨密度和骨矿含量的测定：60只3月龄雌性健康SD大鼠被随机均分4组：假手术(SHAM)组、去卵巢(OVX)组、去卵巢+二甲双胍(OVX+MF)组和去卵巢+雌二醇(OVX+E2)组。OVX组、OVX+MF组和OVX+E2组行双侧卵巢摘除建立骨质疏松模型，SHAM组仅切除双侧卵巢旁等量脂肪。术后1周起OVX+MF组按100 mg/(kg·d)灌胃MF，OVX+E2组按0.1 mg/(kg·d)灌胃17-β雌二醇，其它各组灌胃等量蒸馏水,按体重变化调整药量，连续给药60 d后通过引颈法处死大鼠。分离各组大鼠胫骨,用双能X线骨密度仪(DEXA，prodigy型，美国GE LUNAR公司)测定右侧胫骨骨密度和骨矿含量。

1.2.2大鼠BMSCs的分离、培养：无菌条件下分离4组大鼠双侧股骨和胫骨，在含有抗生素的α-MEM溶液中浸泡10 min后冲洗骨髓腔，800 r/min离心细胞悬液，5 min后用普通培养液重新接种。接种后第3天，用PBS(pH 7.2～7.4)缓慢冲洗掉未贴壁的细胞，培养基每周更换2次,细胞基本铺满瓶底时，用0.25 %胰酶消化，以1∶2进行传代培养。选取生长较好的第3、4代细胞行后续实验。

1.2.3诱导各组大鼠BMSCs向成骨细胞分化：各组大鼠传代细胞以5.0×104个/孔密度接种于24孔板，用基础成骨诱导培养基培养15～21 d后，收集细胞行下一步实验。

1.2.4细胞增殖功能测定和细胞荧光染色：将各组细胞以1.0×104个/孔密度接种在96孔板，成骨诱导液培养6 d后，用MTT法测定细胞活性及增殖能力；培养结束后用PBS冲洗细胞，室温下用钙黄绿色素AM荧光探针培养细胞10 min。

1.2.5碱性磷酸酶活性测定：将各组细胞以5×105个/孔密度接种于6孔板，成骨诱导液培养7 d，用PBS清洗细胞层，溶解于0.5 mL的0.1 % Triton X-100中，使用Bradford法测定细胞提取物蛋白含量。

1.2.6矿化结节形成和钙含量的测定：将各组细胞以5×105个/孔密度接种于6孔板，培养28 d后，PBS洗两次并用95 %乙醇原位固定，1 %茜素红染色，镜下计数钙化结节数目。钙含量测定方法参照文献[4]。

1.2.7RNA提取以及Real-time PCR测定：将各组细胞以5×105个/孔密度接种于6孔板，成骨诱导液培养21 d后，荧光定量实时PCR测定成骨细胞表面基因: collagen type I、OC、OPG、RANKL、IL-6, GAPDH 作为看家基因(引物序列见表1)。反应结束后用双CT法进行PCR相对定量计算。

1.3 统计分析

2 结果

2.1 二甲双胍对去卵巢大鼠骨密度和骨矿含量的影响

与SHAM组比较，OVX组的骨密度和骨矿含量显著降低，OVX+MF组与OVX+E2组的骨矿含量低于SHAM组(P均<0.05)，而骨密度与SHAM组无显著差异(P>0.05);OVX+MF组与OVX+E2组的骨密度和骨矿含量均显著高于OVX组，且OVX+E2组高于OVX+MF组(P<0.05)。见图1。

表1 引物序列Table 1 Primers Sequence

图1 各组大鼠骨密度和骨矿含量注：与SHAM组比较，*P<0.05；与OVX组比较，#P<0.05；与OVX+E2组比较，▲P<0.05。Fig.1 Bone mineral density and bone mineral content of rats in each group

2.2 大鼠BMSCs诱导分化为成骨细胞的形态学观察

倒置相差显微镜下，大鼠BMSCs经差速贴壁后于2～3 h内贴附于培养瓶底(图2 A)，接种3 d后细胞呈现不同形态并向外伸展出生长突，部分细胞借突起相互连接(图2B)；随后生长突相互连接融合成片(图2C)，成骨细胞持续重叠生长，10～12 d后出现散在的致密团块，中央区域逐渐变暗，透光不佳，最终形成结节(图2D)。

图2 大鼠BMSCs诱导分化为成骨细胞的形态(×100) A:细胞培养后1 d；B:细胞接种后3 d；C:细胞接种后5 d；D:细胞接种后12 d。Fig.2 Morphological differentiation of rat BMSCs into osteoblasts (×100) A:1 day after cell culture; B:3 days after cell inoculation; C:5 days after cell inoculation; D:12 days after cell inoculation.

2.3 大鼠BMSCs在诱导培养基中的生长曲线

接种后1～3 d内，传代大鼠BMSCs细胞增殖缓慢，随后细胞增殖速度逐渐增快，第6天达到顶峰，此后逐渐减慢(图3)。

图3 大鼠BMSCs的生长曲线Fig.3 The growth curve of rats BMSCs

2.4 大鼠BMSCs诱导分化为成骨细胞后矿化结节的形成

在矿化诱导液的培养下，大鼠BMSCs分化为成骨细胞并呈重叠生长，逐渐形成大小不一的结节，随着胶原沉积和基质矿化，最终形成密度不均透光性差的矿化结节(图4)。

图4 矿化结节形成的鉴定 A:骨细胞钙化中(诱导后14 d)；B:骨细胞钙化形成(诱导后28 d)。Fig.4 Identification of mineralized nodule formation A: osteoblasts are calcifying (14 days after induction); B: osteocyte calcification is formed (28 days after induction).

2.5 各组大鼠BMSCs分化为成骨细胞后细胞增殖能力、ALP活性与钙沉积量的变化

与SHAM组比较，OVX组成骨细胞增殖能力、ALP活性明显被抑制，钙沉积量明显减少(P<0.05)；与OVX组比较，在给予MF和雌二醇干预后显著增强了大鼠成骨细胞增殖能力和ALP活性，钙沉积量显著增加(P<0.05)；且OVX+E2组成骨细胞增殖能力、ALP活性、钙沉积量高于OVX+MF组(P<0.05)。见图5。

图5 大鼠成骨细胞的增殖能力、ALP活性及钙沉积量的变化注：与SHAM组比较，*P<0.05；与OVX组比较，#P<0.05；与OVX+E2组比较，▲P<0.05。Fig.5 Changes in cell proliferation, ALP activity and calcium deposition in osteoblasts of rats

2.6 各组大鼠BMSCs的形态变化

细胞培养3 d后各组均呈现出成骨细胞的典型形态：多边形、三角形和梭形(绿色细胞)。在图6B(OVX组)中可看到明显增多的呈现红色荧光的死亡细胞，而在图6 A(SHAM组)中几乎看不到死亡细胞；与图6B(OVX组)比较，图6C(OVX+E2组)与图6D (OVX+MF组)中死亡细胞数目减少，细胞呈现融合趋势。

图6 荧光染色大鼠的BMSCs A:SHAM组;B:OVX组;C:OVX+E2组;D:OVX+MF组。Fig.6 Fluorescent staining of BMSCs A: SHAM group; B: OVX group; C: OVX+E2 group; D: OVX+MF group.

图7 镜下成骨细胞矿化结节的形成 A:SHAM组;B:OVX组;C:OVX+E2组;D:OVX+MF组。Fig.7 The formation of mineralized osteoblasts nodules under the microscope A: SHAM group; B: OVX group; C: OVX+E2 group; D: OVX+MF group.

2.7 各组大鼠成骨细胞矿化结节的形成

在矿化诱导液培养21 d后，镜下观察，图7 A(SHAM组)成骨细胞多层重叠生长并随着胶原和钙盐沉积，形成数量较多的矿化结节；而在图7B(OVX组)成骨细胞钙化明显受到抑制，细胞没有显著融合，未见显著的矿化结节；但在图7C(OVX+E2组)与图7D(OVX+MF组)中，成骨细胞重叠生长逐渐形成矿化结节，结节数量较多，周围有较多钙盐沉积。

2.8 各组大鼠成骨细胞的基因表达变化

与SHAM组比较，OVX组中collagen type I、OC、OPG mRNA表达水平显著降低，RANKL、IL-6 mRNA表达显著增强，而OVX+MF组collagen type I、OC、OPG、RANKL、IL-6mRNA的表达水平均高于SHAM组(P<0.05)；与OVX组相比，OVX+E2组、OVX+MF组明显增加了collagen type I、OC、OPG mRNA的表达水平，并抑制了RANKL，IL-6mRNA的表达(P<0.05)；与OVX+E2组比较，OVX+MF组collagen type I、OC、OPG mRNA表达水平低于OVX+E2组，且RANKL、IL-6mRNA的表达高于OVX+E2组(P<0.05)。见图8。

图8 各组大鼠成骨细胞的基因表达注：与SHAM组比较，*P<0.05；与OVX组比较，#P<0.05；与OVX+E2组比较，▲P<0.05。Fig.8 Gene expression of osteoblasts in each group

3 讨论

MF是2型糖尿病患者的首选用药，可通过多种机制影响骨代谢：一方面通过AMPK-mTORC2和AKT-mTORC1信号轴调节SIRT6和OCT4的表达，促进成骨前细胞的增殖和分化[5]；另一方面通过AMPK/Runx2/Cbfa1通路诱使大鼠胫骨BMSCs向成骨细胞分化，刺激矿化结节的形成[6]；此外还能减少晚期糖基化终末产物的产生，逆转和改善高糖对成骨细胞功能的损伤[7]。临床研究[8]发现MF可降低糖尿病患者骨折发生风险，本研究以去卵巢大鼠模拟骨质疏松症，以雌二醇为对照进一步探究MF抗骨质疏松的作用机制。

OPG/RANKL/RANK通路是影响骨代谢最主要的途径[9]。骨吸收因子刺激成骨细胞膜表达RANKL分子，后者与破骨细胞膜上的RANK结合后，诱导破骨细胞膜上肿瘤坏死因子受体相关因子与RANK的胞内区结合并激活下游多种细胞内信号传导通路，上调促骨吸收因子的表达，促进破骨细胞分化成熟，增强骨吸收活性[10]。而由成骨细胞生成的OPG可竞争性与RANKL结合，阻止这些信号转导途径，负性调节破骨细胞的生成[11]。雌激素缺乏会使OPG/RANKL比例失调，破骨细胞活性增强，诱使发生骨质疏松[12]。本研究中，去卵巢大鼠BMSCs向成骨细胞的分化受到抑制，collagen type I、OC、OPG mRNA表达明显受到抑制，而RANKL、IL-6 mRNA表达水平明显增加，给予雌二醇干预后，去卵巢大鼠的collagen type I、OC、OPG mRNA表达显著增强，而RANKL、IL-6mRNA表达明显减弱，由此导致其骨密度以及骨矿含量也显著增加，雌二醇显著逆转了去卵巢大鼠的骨质疏松；用MF干预去卵巢大鼠BMSCs后，collagen type I、OC、OPG mRNA表达显著增强，RANKL、IL-6 mRNA表达明显减弱，且MF对collagen type I、OC、OPG mRNA的表达表现出强于正常对照组的特性，提示MF通过OPG/RANKL/RANK通路增加成骨细胞活性，抑制破骨细胞分化，发挥骨保护作用，尤其在增强成骨细胞活性方面有优势。体外培养SD大鼠的BMSCs并给予100 μmol/L MF孵育21 d后发现，BMSCs中促成骨基因表达增加而促成脂基因表达减少,且MF显著促进矿化结节的沉积，阻断胞质脂滴的形成，提示MF可诱使BMSCs成骨分化而抑制其脂向分化[13]。在本研究中亦发现MF可进一步诱导去卵巢大鼠BMSCs向成骨细胞分化，显著增强ALP活性和成骨细胞的钙化能力，并增加其骨密度和骨矿含量，虽然MF的作用弱于雌二醇，但仍能有效改善去卵巢大鼠骨质疏松的状态。

本研究的不足之处在于未进行MF不同剂量的对比，不能排除剂量对研究结果的影响；此外，MF对骨代谢影响可能与动物的种系、年龄、体重以及体内激素水平和炎症状态等有关，因此仍需要大量的基础和临床研究进一步证实MF对骨代谢的影响。

总之，本研究结果表明，MF不仅增加了去卵巢大鼠的骨密度和骨矿物含量，增强了成骨细胞增殖和钙化能力以及ALP活性，还可经由OPG/RANKL/RANK途径诱导BMSCs向成骨细胞分化，阻碍破骨细胞的成熟。尽管MF的抗骨质疏松作用逊于雌二醇，但其在促进成骨细胞基因表达活性方面有优势，MF潜在的骨保护作用可能会改善糖尿病所引起的骨质疏松症。