基于网络药理学对龟甲抗骨质疏松的作用机制研究

李晶峰 李春楠 杨小倩 郅慧 王亚平 张辉 孙佳明

长春中医药大学吉林省人参科学研究院，吉林 长春 130117

骨质疏松症(osteoporosis，OP)是一种常见疾病，其特征是骨密度(bone mineral density，BMD)普遍降低，骨组织微结构恶化，骨折风险增加。龟甲是中医临床常用的抗骨质疏松药物，具有滋养肾阴之功效，可生髓益肾强骨，固经止血，补心安神。龟甲对糖皮质激素性骨质疏松大鼠腰椎、胫骨骨密度和骨强度均有改善作用[1]，龟甲能够使糖尿病性骨质疏松患者骨密度显著上升[2]，但对于龟甲治疗骨质疏松的药效物质基础与机制报道却很少。因此，分析龟甲的活性成分、作用靶点及其可能作用的机制有利于阐述龟甲的科学内涵，并促进其临床应用。

网络药理学通过构建“疾病-基因-靶点-药物”相互作用网络，揭示多种化合物协同作用于人体的机制。中药及其复方药味较多，化学成分复杂，往往具有药效分散、靶向众多的特点。而正是由于多靶向作用原理，弥补了中药复方针对单靶点药效不强的缺陷，表现出整体治疗、协同调理并举的特色，体现了中药“物质基础-药性-药效”的关系特点[3]。

本研究通过对龟甲成分与骨质疏松靶点进行对比，筛选龟甲中治疗骨质疏松有效成分及相关靶点，通过KEGG通路分析，合理推断龟甲治疗骨质疏松作用机制，为龟甲的现代药理学研究提供参考，也为其他中药的相关研究提供借鉴。

1 数据库

BATMAN-TCM 数据库、 TTD数据库、DrugBank数据库、DisGeNET数据库、OMIM数据库、KEGG数据库。

2 方法

2.1 龟甲化学成分的收集

本研究综合BATMAN-TCM数据库及文献调研，构建了龟甲化学成分数据库。经数据库查询与文献检索共得到40个化合物[4-7]。

2.2 龟甲化学成分靶点的获得

龟甲化学成分靶点从BATMAN-TCM数据库获得，数据库没有靶点的化学成分，利用SwissTarget Prediction，得到化合物靶点，将靶点通过Uniprot网站标准化为Uniprot ID。

2.3 骨质疏松靶点的获得

在TTD数据库、Drugbank 数据库、DisGeNET数据库、OMIM数据库中输入“Osteoporosis”，得到骨质疏松疾病的靶点，靶点标准化为Uniprot ID。

2.4 通路富集分析

基因本体论(gene ontology，GO)是用于描述基因产物功能并广泛应用的一个本体，它能够在基因组规模下和不同物种之间对给定基因集进行功能注释。京都基因与基因组百科全书(kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)是一个整合了基因组、化学和系统功能信息的数据库，用于从分子水平信息了解细胞、生物体和生态系统等生物系统。本研究采用在线分析工具Metascape，对龟甲活性化学成分靶基因KEGG富集分析、龟甲治疗骨质疏松靶基因进行GO、KEGG富集分析[8]。

3 结果

3.1 龟甲活性成分

数据库与文献共收集龟甲活性成分40个，其中包括氨基酸、脂肪酸、酯类、甾醇类、其他类，见表1。

表1 龟甲活性成分的主要信息

3.2 龟甲活性成分靶基因KEGG通路富集分析

龟甲成分通过数据库共收集530个靶基因，利用Metascape对龟甲活性成分靶基因进行KEGG富集分析。P值排名前20的KEGG代谢通路在图1 A中表示，聚类网络树见图1B。

图1 龟甲活性成分靶基因KEGG富集分析图 A：富集项热图；B：富集项网络图。Fig.1 KEGG enrichment of active components in tortoise shell A: Heat map of enriched; B: Network of enriched termsterms.

龟甲活性化合物关键靶点的KEGG富集分析如表2所示，这些基因主要与神经活性配体-受体相互作用、氨酰- tRNA生物合成、谷氨酸能突触等信号通路相关。

3.3 龟甲治疗骨质疏松靶基因功能与通路富集分析

3.3.1龟甲抗骨质疏松靶基因对应化合物分析：龟甲成分筛选出530个靶基因，骨质疏松筛选出84个靶基因，骨质疏松与龟甲成分交集共15个基因：UGT2B17、PTGS2、SLC22A6、SLC22A10、PTGER2、SRC、COMT、TNF、ESR1、CYP19A1、ESR2、AR、PGR、ITGB3、FDPS。这些靶点对应的化合物有脂肪酸类6个、氨基酸类4个、甾醇类5个、其他类2个，见表3。

3.3.2龟甲抗骨质疏松靶点-功能相关蛋白网络拓扑参数分析：分析蛋白质相互作用网络的拓扑特性，不仅有助于研究未知蛋白质的生物学功能，也为进一步研究蛋白质之间如何通过相互作用来完成生命活动提供理论依据。蛋白质节点自由度越大则表明其参与的生物功能越多，其生物学重要性越强；平均最短路径长度越小说明蛋白越重要。节点距离其他节点越近，则接近中心性越大[9]。应用Network Analyzer得到15个靶点的相关拓扑数据，排名前7位的PTGER2(EP2)，ITGB3，PGR，SRC，FDPS，COMT，TNF为龟甲治疗骨质疏松的关键靶点，如表4所示为关键靶点相关拓扑参数。前列腺素(prostaglandins，PG)在调节骨对机械刺激反应中起重要作用。前列腺素E2(PGE2)是骨代谢的有效调节因子。PGE2对骨的影响是通过四种受体(EP1、EP2、EP3和EP4)介导的。EP2受体对小鼠骨骼生物力学性能的影响较大，EP2受体缺失导致小鼠骨生物力学强度降低[10]。破骨细胞的激活会导致破骨细胞特异基因ITGB3的表达[11]。 SCR在骨代谢中发挥重要作用，SCR家族酪氨酸激酶参与矿物形成[12]；血小板衍生生长因子BB在人成骨细胞分化和增殖中起着重要作用，血小板衍生生长因子BB还上调成骨相关基因的表达，促进矿物质结节的形成，SCR参与这些过程[13]。儿茶酚-O-甲基转移酶(catechol-o-methyltransferase，COMT)多态性可以改变骨微环境和/或循环中的雌激素状态，从而调节身体活动与骨参数之间的关联[14]。法尼基焦磷酸合酶(farnesyl diphosphate synthase，FDPS)与氨基双膦酸盐治疗后的骨密度和骨转换标志物的变化有关[15-16]。骨代谢涉及骨保护素(OPG)及其配体在内的肿瘤坏死因子(TNF)受体家族，OPG是TNF受体超家族的细胞因子，TNF-α和Il-1β可升高OPG水平[17]。

表2 龟甲活性成分靶基因KEGG富集分析Table 2 KEGG enrichment of active components in tortoise shell

表3 龟甲抗骨质疏松15个靶点对应的化合物

图2 龟甲抗骨质疏松靶基因的GO富集分析 A：GO富集项热图；B：GO富集项网络图。Fig.2 GO enrichment of the target gene of tortoise shell anti osteoporosis A: Heat map of enriched terms across input gene lists; B: Network of GO enriched terms.

3.3.3龟甲抗骨质疏松靶基因GO通路富集分析：龟甲抗骨质疏松靶基因共15个，基于Metascape平台进行GO富集分析，GO富集项见图2。龟甲抗骨质疏松靶基因GO富集分析见表5，主要与对类固醇激素的反应、上皮细胞增殖的调控、脂质定位的调节等相关。类固醇激素是一类具有神经活性的甾体激素，由肾上腺皮质分泌，临床应用广泛，但长期使用会产生骨质疏松症[18]；绝经后骨质疏松症患者血清高密度脂蛋白胆固醇和总胆固醇水平较高[19]；糖皮质激素性骨质疏松是一种药物性继发性骨质疏松，主要由骨形成抑制引起，与成骨细胞的增殖和功能密切相关[20]。

表4 龟甲治疗骨质疏松靶基因的拓扑参数

3.3.4龟甲抗骨质疏松靶基因KEGG通路富集分析：利用Metascape在线工具对龟甲抗骨质疏松15个靶基因进行KEGG富集分析，P值排名前3的KEGG代谢通路见图3。结果表明,这些基因主要与类固醇激素生物合成、甲状腺素信号途径、癌症的途径信号通路相关，分析见表6。雌激素是一种类固醇激素，雌激素水平的降低可导致骨质疏松[21]。 Xia T[22]的研究表明熟地黄提取物主要通过干预类固醇激素的生物合成来预防糖皮质激素引起的骨质疏松。Arnautovic-Halimic A[23]评价绝经后正常甲状腺妇女骨质丢失早期和晚期甲状腺素水平及骨密度比值，患有骨质疏松症的患者组和保留骨量的患者组的促甲状腺素(thyroid-stimulating hormone，TSH)和游离三碘甲状腺原氨酸(free triiodothyronine，FT3)的平均水平没有显著差异，而患有骨质疏松症的血清妇女的游离甲状腺素(free thyroxine，FT4)的平均水平与对照组相比在统计学上显著降低，甲状腺素(TSH)状态的生理变化可能是骨质疏松症发生的早期指标。Kim等[24]证明在健康的甲状腺功能正常的妇女中，TSH值与低矿物质骨密度有关。在某些绝经后妇女中，骨质疏松症已被认为是雌激素受体阳性乳腺癌治疗的晚期效应[25]。RANKL是肿瘤坏死因子(TNF)家族的一员，RANKL上调时会促进破骨细胞分化，并导致过度的骨吸收，从而导致骨完整性丧失[26]。RANKL同时参与了乳腺肿瘤的发生，在RANK和RANKL受体缺陷小鼠的研究中，哺乳期的乳腺没有发展为癌症[27]。在另一项研究[28]中，小鼠乳腺癌变的发展与RANKL表达增加有关，并且加速RANK转基因小鼠乳腺癌变。前列腺癌患者因癌症治疗会引起骨质流失并存在骨折的危险，并面临着病理性骨折、严重骨痛和其他骨转移后遗症的风险[29]。

图3 龟甲抗骨质疏松靶基因的KEGG富集分析Fig.3 Key target pathway enrichment analysis of tortoise shell for osteoporosis

表5 龟甲治疗骨质疏松靶基因GO功能富集分析Table 5 GO network enrichment analysis of key network targets of tortoise shell for osteoporosis

表6 龟甲治疗骨质疏松靶基因KEGG富集分析Table 6 Key target pathway enrichment analysis of tortoise shell for osteoporosis

3.3.5龟甲-成分-靶点-通路网络图:利用Cytoscape软件建立了龟甲11种活性化合物、15个靶基因与3条通路之间的龟甲-成分-靶点-通路网络图，如图4所示。

图4 龟甲-成分-靶点-通路网络图注：代表龟甲，代表成分，代表靶点，代表通路。Fig.4 network of tortoise shell-component-target-pathway

4 讨论

OP是一种骨代谢疾病，临床表现主要为骨结构异常、骨脆性增高和骨量减少，易出现骨折，严重影响患者的生活质量[30]。龟甲具有滋阴潜阳、益肾强骨之功效，可促进骨髓间充质干细胞向成骨细胞方向分化[31]，并对骨质疏松有较好的治疗效果[32]，符合“肾主骨，生髓”的中医基础理论，可作为补肾类治疗OP的中药。

龟甲中主要含有氨基酸、脂肪酸等成分，Su Y等[33]分析的1 424名男性和1 573名女性(平均年龄72岁)中，血清缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸和色氨酸浓度与髋部骨密度有关，血清总同型半胱氨酸浓度与骨密度相关，较高的血清色氨酸浓度有可能降低发生骨质疏松性骨折的风险，男性血清中同型半胱氨酸的含量与骨质疏松性骨折相关；骨骼摄取的脂肪酸很可能被加工以生成ATP，因为体内骨从头合成脂质的测量值较低，血清脂蛋白对正常成骨细胞增殖是必需的[34]，成骨细胞可以氧化脂肪酸，脂肪酸氧化产生的能量能够促进骨形成[35]，随着成骨细胞体外成熟，脂肪酸氧化显著增加[36]；碳酸钙能提高骨质疏松大鼠的抗氧化能力，增加骨密度，提高血清钙水平，减少骨矿流失，从而防治骨质疏松症[37]。

将宏观药效与微观药物分子机制有机结合，在中医理论要求的整体层面上对龟甲单味药与机体的交互作用进行分析，同时联系现代医学“基因-疾病-药物”研究模式进行新的药物靶点、作用通路预测极具意义。本研究应用网络药理学方法初步探讨了龟甲活性成分、相关靶点、龟甲治疗骨质疏松靶点及其相关通路，构建了龟甲-成分-靶点-通路网络图。预测了龟甲治疗骨质疏松的相应靶点及通路，涉及类固醇激素、甲状腺素、癌症等多个环节，各通路间通过共有靶点连接，阐明龟甲不同成分间的多靶点、多途径的协同作用。