脑脊液cfDNA对急性早幼粒细胞白血病合并中枢神经浸润的诊断价值

张 媛，黄 琰，王莉华，刘宪凯，吕国庆，吴 隼

新乡医学院第一附属医院 血液内科，河南 卫辉453100

急性早幼粒细胞白血病(APL)是一种造血系统的恶性克隆性疾病。随着研究的深入和治疗方法的进步，APL已成为可以治愈的白血病之一。但是伴随APL缓解率的提升和生存期的延长，中枢神经系统浸润(CNSL)成为大部分APL 患者复发的首要表现，也是影响APL患者预后的重要因素[1]。由于目前中枢浸润的早期诊断缺乏特异性和敏感性，如何在适当的时间正确评价及治疗中枢神经系统白血病，仍然是APL临床治疗所面临的巨大挑战。近年来，细胞游离DNA(cfDNA)在恶性肿瘤的早期诊断以及预后预测成为研究的热点。cfDNA 是指存在于血液、滑膜液等体液中的细胞外DNA，在健康人群的循环血中含量极微[2]。研究[3-4]显示，肿瘤患者cfDNA 水平远高于正常人，并且其含量与肿瘤负荷及复发呈正相关性。本研究通过对APL 患者脑脊液cfDNA 进行定量及定性研究，分析其在APL 合并中枢浸润早期诊断中的临床价值和指导意义。

1 对象与方法

1.1 研究对象

选取2017年6月至2019年8月在我院治疗的APL、APL合并CNSL、结核性脑膜炎(TBM)、无中枢神经系统疾病(对照组)患者各20 例，共80 例。其中男性各13例，女性各7例，年龄7～56岁，平均年龄(33.59±5.14)岁。所有APL患者均符合张之南第三版《血液病的诊断及疗效标准》的诊断标准。APL合并CNSL患者在符合上述诊断标准之外，参照1985年罗马谈论提出的CNSL 的诊断意见及临床表现，脑脊液白细胞计数＞0.005×109/L。结核性脑膜炎患者的确诊及排除符合国家统一制定的肺结核诊断标准(WS288-2008)。以行腰椎穿刺术，并最终排除中枢系统疾病的患者纳为对照组。排除合并风湿性关节炎、干燥综合征等免疫性疾病患者，排除合并肝肾功能损伤、HIV 或疱疹病毒感染、肝炎病毒感染以及其他恶性肿瘤患者。本研究经我院医学伦理委员会批准，所有患者均签署知情协议书。

1.2 cfDNA定量及定性检测

治疗前APL、APL 合并CNSL、TBM、对照组患者行腰椎穿刺后留取1 mL 脑脊液，采用cfDNA提取试剂盒(广州吉塞生物科技股份有限公司)提取脑脊液cfDNA，测量cfDNA 浓度并换算至血浆cfDNA 浓度。提取后的cfDNA 进行琼脂糖凝胶电泳，比较cfDNA 的片段大小及分布。

1.3 PML-RARA RT-PCR

收集APL、APL 合并CNSL、TBM、对照组患者脑脊液1 mL，采用细胞总RNA 提取试剂盒和逆转录试剂盒(天根生化科技北京有限公司)提取总RNA，并逆转录为cfDNA。从NCBI上查询人源PML-RARA 核苷酸序列，并设计RT-PCR 引物。PML-RARA-F:5'-ggcagttcataatgcatc-3'；PMLRARA-R:5'-tccctgagatagggggag-3'；以U6为内参；U6-F:5'-gtgctcgcttcggcagcac-3'，U6-R:5'-atatggaacgcttcacga-3'。根据RT-PCR 试剂盒(美国Thermo Fisher Scientific)说明配置反应体系，并设置RT-PCR 反应程序为:95℃30 s，55℃30 s，72℃30 s，35 个循环。采用2-ΔΔCt法分析PMLRARA 的m RNA 相对表达水平。

1.4 脑脊液生化及常规检验

APL、APL合并CNSL 患者治疗前、治疗后分别取1 mL脑脊液进行cfDNA 定量、常规和生化检查、白细胞计数；采用雅培C8000 全自动生化分析仪检测脑脊液蛋白(M-TP)、脑脊液氯化物(Cl)和脑脊液葡萄糖(Glu)的含量。

1.5 统计学方法

采用SPSS 21.0统计软件进行数据处理，计量资料采用平均数±标准差()表示，计数资料采用率(%)表示，两独立样本比较采用单因素方差分析，APL、APL合并CNSL、TBM、对照组组间比较采用LSD-t检验。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 cfDNA 定量及定性检测

cfDNA定量显示:对照组(24.40±2.96)ng/m L，TBM 患者(56.83±6.71)ng/m L，APL 患者(103.05±9.44)ng/m L，APL 合并CNSL 患者(147.61±12.15)ng/m L。与对照组、TBM 患者比较，APL患者和APL合并CNSL患者的脑脊液中cfDNA 含量增加，差异有统计学意义(P＜0.05)。对照组、TBM 患者的脑脊液cfDNA 片段主带大小约为160 bp及其倍数，APL和APL 合并CNSL 患者cfDNA 片段主带大小约为140 bp，并且片段大小不等，见图1。

图1 cfDNA电泳图

2.2 RT-PCR 检测PML-RARA 的表达

RT-PCR 结果显示:APL 患者和APL 合并CNSL患者PML-RARA 表达阳性率分别为95%、100%，PML-RARA 相对m RNA 表达水平分别为1.26±0.20 和1.78±0.21。与APL 患者比较，APL合并CNSL 患者的PML-RARA 相对m RNA表达水平明显增加，差异有统计学意义(P＜0.05)。

2.3 治疗前后脑脊液cfDNA、WBC比较

与治疗前比较，APL 患者和APL 合并CNSL患者治疗后脑脊液中cfDNA 和WBC 的含量明显下降，差异有统计学意义(P＜0.05)；与APL 患者比较，APL合并CNSL患者治疗前cfDNA 和WBC的含量增加，差异有统计学意义(P＜0.05)。见表1。

2.4 治疗前后脑脊液M-TP、Cl、Glu比较

与治疗前比较，APL患者和APL合并CNSL患者治疗后脑脊液中M-TP的含量降低(P＜0.05)，Cl和Glu的含量升高(P＜0.05)；与APL 患者比较，APL合并CNSL 患者治疗前M-TP 的含量增加(P＜0.05)，Cl和Glu的含量下降(P＜0.05)。见表2。

表1 治疗前后脑脊液cfDNA、WBC含量比较

表2 治疗前后脑脊液M-TP、Cl、Glu含量比较

3 讨论

cfDNA 通常来源于细胞凋亡或坏死。生理条件下，细胞裂解后释放到外周环境中的cfDNA 会被实时清除并保持在较低的水平，但在肿瘤疾病中，不均衡的血液供应和过快的新陈代谢导致细胞大量坏死和凋亡，原发灶肿瘤细胞、循环血液肿瘤细胞、微转移病灶和正常细胞释放大量的cfDNA[5-6]。部分文献[7-8]报道，炎症亦可引起cfDNA 的升高，但未提示与肿瘤cfDNA 的含量、片段的长短是否存在异常。有学者[9]发现，肿瘤患者血浆ct DNA 含量明显增多，提出了外周血ctDNA 水平在监测疗效、预测复发方面的作用。基于cfDNA 检测微创性、取材简易方便及适合动态研究等优点，在各种恶性肿瘤早期诊断、进展、监控及预后判断中具有重要的临床意义，被认为是一种具有潜在临床应用价值的肿瘤靶分子的检测方法。目前的研究显示:cfDNA 在实体肿瘤中具有重要的意义，但是在急性白血病中应用的文献少见。本研究旨在进一步探究cfDNA是否可以应用于APL合并中枢浸润的早期诊断。

研究显示:健康人群cfDNA 主要通过淋巴细胞和其他有核细胞的凋亡释放，最终被降解为180～200 bp的片段，平均浓度为30 ng/m L。肿瘤患者血浆中cfDNA 的平均浓度可达180 ng/m L，而且其片段大多小于180 bp[10-11]。健康人群和良性疾病患者、恶性疾病患者的cfDNA 浓度存在重叠，因此，仅以cfDNA 浓度作为诊断的标准缺乏特异性。本研究结果显示:APL 组和APL 合并CNSL 组脑脊液中cfDNA 的含量较正常人群和TBM 患者明显增加，cfDNA 片段大小降低，且杂带多，提示APL、APL合并CNSL患者体内cfDNA 的完整性遭到破坏，cfDNA 的含量与APL的发病有显著的相关性。

90%以上的APL患者具有特异的15号染色体上的早幼粒细胞白血病基因(PML)和17号染色体维甲酸受体α基因(RARA)染色体易位[12-13]。15号染色体断裂点位于PML 基因两个断裂点集中区域内，17号染色体断裂点位于RARA 基因的一个17 kb的内含子2中，产生L 和S两种不同长度的PML-RARA 融合转录本[14-15]，通过RT-PCR 可准确鉴定出PML-RARA 型APL。本研究结果表明，APL、APL合并CNSL患者中PML-RARA 的阳性表达率无明显差异，但APL 合并CNSL 患者的PML-RARA m RNA 表达水平较APL 患者明显增加，提示PML-RARA 的表达与中枢神经系统的浸润密切相关。

为进一步阐明cfDNA 在APL、APL合并CNSL患者鉴别诊断中的意义，对成功治疗后的APL、APL 合并CNSL 患者脑脊液中的cfDNA、WBC、M-TP、Cl和Glu的含量进行了检测。结果显示:与治疗前比较，治疗后APL、APL 合并CNSL 患者脑脊液中cfDNA 的含量均显著下降；WBC、M-TP、Cl和Glu 的含量也随治疗疗效相应改变。此外，与APL比较，APL合并CNSL 患者治疗前cfDNA 的含量更高。提示cfDNA 含量的变化在APL、APL合并CNSL患者的鉴别诊断以及APL 病程的监测中具有重要意义。

综上所述，cfDNA 的含量和完整性与APL 患者的病程进展和临床特征显著相关，有望用于APL、APL合并CNSL的早期诊断和预后评估。