生长分化因子在椎间盘退行性病变中的研究进展

杨荣，赵刚

(昆明医科大学第二附属医院创伤外科，云南 昆明)

0 引言

腰痛是椎间盘退变患者最常见的就诊原因，也是影响生活和工作的重要因素[1]。尽管导致腰痛的原因复杂繁多，但椎间盘(IVD)退变早已被证实为主要病因[2，3，4]。IVD 是位于椎体间的纤维软骨组织，约占脊柱总长度的1/3[5]。椎间盘具有增大脊柱运动幅度、承受压力、缓冲震动、保护大脑和脊髓的作用[6]。IVD 变性是由细胞驱动的髓核细胞退变、髓核细胞外基质退变、软骨终板和纤维环退变，其中最主要的是髓核细胞的减少与细胞外基质改变，导致髓核(NP)和纤维环(AF)机械故障，AF 进行性破裂，最终导致NP 突出，这一过程同时伴随着血管的生长和刺激性神经纤维进入炎症椎间盘，进而使免疫细胞浸润，伴发疼痛。IVD 变性可因过度的体力劳动、潜在的遗传因素和衰老而加剧[7,8]。目前的治疗方案有限，主要以缓解疼痛症状为主，而不是纠正病理改变。治疗上包括保守治疗和手术治疗。保守治疗包括服用止痛药物及抗炎药物、理疗等。其次是手术治疗，手术治疗是保守治疗无效的最终方法，但是椎间盘摘除、脊柱融合等手术成本高，其治疗结局并不十分令人满意，而且容易加速邻近节段退变。生物治疗旨在恢复IVD 稳态并使受损组织再生，主要是恢复NP 和AF 组织的结构和功能。因此，生物疗法在临床前研究中展现出了前景，生物疗法包括生物分子疗法、细胞疗法、组织工程方法。生物分子疗法是通过诱导细胞减少分解因子，或者增加合成因子，从而促使细胞外基质再生。生物分子和基因疗法能够在蛋白和基因水平改变细胞生物合成，其中一类因子—生长分化因子( GDFs )具有关键作用，包括促进NP 细胞的分化和维持软骨组织稳态[9-12]。因此本文重点关注GDF 家族对IVD 修复再生的潜在治疗作用。

1 椎间盘(IVD)的结构、功能及退变

椎间盘(IVD)包括三个部分：髓核(NP)、纤维环(AF)和软骨终板( CEPs )，构成人体中最大的无血管结构。IVD 的性质和功能取决于其特定的微结构，而这些微结构又由不同的细胞群体产生。NP是一种富含阴离子蛋白多糖的细胞外基质，以聚糖为主，它们以27：1 的比例(聚糖：胶原) 排列在不规则的Ⅱ型胶原网中[13-17]。阴离子蛋白多糖分子的高密度特性能够吸引并保留水分，使NP 能够抵抗压力载荷。NP 由AF 包围，纤维环由外、中、内三层呈同心圆排列的纤维构成，纤维环中外层纤维紧密地附着于两个椎体的垢环之间，内层纤维连于上下软骨终板上，纤维环2/3 由胶原组成[18-20]。AF 外层95 %以上为Ⅰ型胶原蛋白，在靠近NP 的部分Ⅰ型胶原蛋白数量几乎呈线性降下至5 %以下。CEPs 固定并维持NP 和AF 的位置和形状，并且充当半透膜屏障，支持营养物质和液体交换[21-24]。

椎间盘变性时，NP 细胞合成的Ⅱ型胶原逐渐被Ⅰ型胶原取代，蛋白多糖合成减少，导致NP 与AF 的界限不清。蛋白多糖含量是维持NP 正常功能的重点，软骨细胞产生的蛋白多糖与胶原的比值比髓核细胞低[25]。椎间盘退变时髓核缺乏保水性导致圆盘高度降低，从而失去将脊柱应力均匀分布到纤维环的能力，从而产生高压区。退行性NP 和AF 产生许多促炎细胞因子，包括白细胞介素( IL )、干扰素( IFN ) 、肿瘤坏死因子α ( TNF-α )和前列腺素E2 ，这些趋化因子诱导免疫细胞作用于退行性IVD，从而引发了NP 和AF 细胞的一系列病理反应，包括NP 标记基因失调，以及引发自噬、衰老和凋亡等反应[26-28]。同时退行性NP 和AF 细胞增加了基质降解酶的表达，加速了Ⅱ型胶原和富含蛋白多糖的ECM 的丢失。对于椎间盘，特别是髓核再生治疗的重点是阻止退变进程、恢复正常ECM 生成、逆转分解代谢进程以及减少炎症反应。

2 当前椎间盘退变治疗和再生治疗的进展

保守治疗椎间盘退变可促进轻度退变的椎间盘自我修复，这些疗法可以改善患者的生活质量，但并不能阻止IVD 退变进程。当保守治疗失败时，手术作为最终选择，在已发生IVD 突出的地方行椎间盘切除仍是手术的金标准，脊柱融合得到了广泛的应用[29]。尽管短期内效果良好，但是由于所有手术过程都是有创且不可逆转的，术后可能出现手术相关并发症，如脊柱的应力改变，脊柱融合可能导致邻近融合部位的IVDs 加速退变[30]。

总之，目前可用的手术治疗方案缺乏在必要的细胞和分子水平上中止和纠正IVD 退变级联反应和炎症环境的能力。分子生物学和生物材料学的进步使IVD 再生疗法变得切实可行。随着对IVD 生理学以及退变病理学的认识不断提高，人们提出的与之相关的治疗方案和分子靶点的数量也不断增加，包括细胞材料和脱细胞生物材料植入、基于信号蛋白的转化生长因子和基因疗法等。目前临床上最简单、最经济的方法是向局部注入生物活性分子，如生长因子、形态发生因子、抗代谢因子、小分子抑制剂、细胞因子或趋化因子等[31]。然而，由于生物活性因子复合物潜在的可变性和不可预测性，目前的研究主要集中在寻找具有治疗潜力的单一生物分子上，最常用的候选分子是抗分解/合成代谢蛋白，其目的是恢复IVD 的稳态，特别是恢复NP 的代谢平衡[32]。GDF 家族成员(包括GDF5(BMP14，CDMP-1)、GDF6(BMP-13，CDMP-2)和GDF7(BMP-12))可能是IVD 再生的理想分子。GDF 不仅促进IVD 细胞中ECM 基因合成代谢表达，而且在IVD 的发育和稳态中具关键作用。

3 IVD 发育中的生长分化因子、稳态和再生潜力

生长分化因子最早从牛的软骨中发现，是骨形态发生蛋白(BMP) 家族的成员。GDF 家族成员之间氨基酸同源性为80-86%，与BMP 家族同源性在50% 左右[33,34]。BMP 家族成员在蛋白质结构和氨基酸序列相似性的基础上，又细分为BMP2/4 组、BMP-5/6/7/8 组、BMP-9/10 组和GDF5/6/7 组。虽然大多数BMP成员如BMP-2/4、BMP-7 和BMP-9/10 等均表现出较强的骨诱导活性，但GDF5/6/7 主要诱导软骨、肌腱和韧带样组织生成[35]。与其他BMP 家族成员一样，GDF 信号通过含有I 型和II 型受体的跨膜丝氨酸-苏氨酸激酶受体多聚体传导。GDF5 和GDF6 通过Ⅰ型受体BMPR-1A 和-1B 及Ⅱ型受体BMPR2、ACVRIIA 和ACVRIIB 起作用[36,37]，除此之外这些途径还与炎性细胞因子信号传导相关。最近的证据表明GDFs 也能激活这些非Smad 途径，特别是Erk1/2[38]，这些非经典BMP 受体提供了诸如GDF6 因子的合成和分解代谢信号传导途径，这是IVD 变性的特征之一。GDFs与促炎分子的这种潜在的相互作用表明了退变过程中存在着调控失调。在体外，GDF6 增加NP 退化细胞产生ECM，而在体内GDF6 可以阻止羊模型中的ECM 降解[39]。在小鼠模型中，过表达人GDF6 可使炎症因子的血浆水平下降[40]。

最近的一篇研究表明GDF6 是骨髓间充质干细胞(MSCs )分泌的抗衰老因子，其表达受到miR-17 的调控，miR-17 是一种随年龄而下降的microRNA[41]，这可能对与衰老过程密切相关的IVD 变性进展具有重要意义。最近人们对GDF6 在人胎儿脊柱发育中的表达及定位进行了研究。GDF6 的强表达尤其表现在发育早期(孕8-13周)和发育中期(孕8-19 周)的IVDs 软骨区域中。GDF6 表达定位在NP 和内AF，但免疫组织化学染色未能在外AF 中检测到[12]。在成年人中，GDF5 和GDF6 在内、外AF 中均可检出，但在NP 中表达最强烈[42]，这表明GDF 家族对合成代谢基因表达具有重要性。

4 GDFs 在体内对IVD 再生和传递方式的影响

GDFs 除了驱动细胞分化外，还能促进IVD 细胞的合成代谢，特别是对NP 细胞和体外软骨细胞。这表明GDF 在正常IVD 中具有保护作用，而在退变性椎间盘中可能失调。在已报道的体外培养中，GDF5 和GDF6 对细胞有相似的作用，在培养物中重组GDF5诱导人NP 细胞产生更多II 型胶原和蛋白多糖[42]，在小鼠IVD 细胞、牛NP 和AF 细胞培养中GDF5 同样有剂量正相关性。在牛细胞培养中GDF5 都使AF 和NP 细胞的蛋白多糖和胶原蛋白生成增加，但NP 细胞反应更强烈，尤其在蛋白多糖产生方面[43,44]。

Zhang 等通过腺病毒介导的过表达研究了不同BMP 家族分子对牛AF 细胞外基质生成的影响，发现GDF6 过表达诱导生成较多蛋白多糖和胶原[45]。在人NP 和AF 细胞的3D 藻酸盐珠培养中添加GDF6 同样增加了蛋白多糖和胶原数量[46,47]。这一结果支持GDF6 同样可以作为软骨细胞趋化剂。综合来看，这些结果说明GDF5 和GDF6 在NP 和AF 细胞合成代谢中具有直接的信号传导作用，这种作用对正常的NP 细胞ECM 影响最大。

5 体外补充GDFs 对椎间盘细胞和软骨细胞的影响

许多生长因子被作为间充质干细胞(MSCs)NP 样分化的诱导剂，包括TGFβ、IGF-1、FGF-2 和PDGF[48,49]。然而，这些研究关注的是一般软骨形成标记物，而不是与NP 分化特定相关的标记物。GDF5 和GDF6 被证明可诱导软骨形成基因的表达，更重要的是还可诱导NP 特异性基因表达。当GDF5 作为MSCs 或脂肪干细胞(ASCs)高浓度培养基的添加剂时，软骨分化增加，这对于髓核来说是不可取的。然而，在研究NP 细胞的报道中存在类似GDF5 反应的证据有限，这意味着目前在干细胞群体中观察到的这种反应对于GDF5 直接应用于退行性椎间盘的意义尚不清楚，需要进一步的体外和体内研究。

在比较研究中，GDF6 在人间充质干细胞(MSCs)和脂肪干细胞(ASCs) 中均比GDF5 促进更多的NP- 标记物基因表达[50,51]，诱导产生更多蛋白多糖，细胞外基质蛋白多糖是正常髓核所必需的。Nochi 等[52]利用腺病毒介导的GDF6 构建间充质祖细胞(C3H10T1/2 细胞)的研究进一步支持这一发现，在使用GDF6时减弱了软骨内骨化的进展，增强了NP 标记物的表达、增加了蛋白多糖的生成，同时观察到比GDF5 更高的糖蛋白/ Ⅱ型胶原比例，有力地说明GDF6 是最有希望从MSCs 或ASCs 中植入NP 细胞表型的候选物。

6 结论与展望

生物分子疗法治疗退行性椎间盘疾病的前景广阔，在生物分子疗法中选择正确的生物活性分子和治疗靶点至关重要。GDF 家族成员无论是作为直接的趋化因子传递给NP 细胞，还是作为NP特异性分化的诱导因子传递给MSCs 或ASCs，都表现出了巨大的前景。无论在哪种情况下，GDF6 均可促进Ⅱ型胶原和蛋白多糖生成增加，并增强NP 特异性标记基因的表达。今后的研究应更深入研究生长分化因子在椎间盘中传导、控制和释放机制。GDF与细胞治疗的结合应用值得关注，目前人们正在努力寻找治疗的最佳细胞群。由于退行性IVD 的促炎环境与非经典GDF 细胞因子信号传导通路的趋同性，需要进一步研究它们之间的相互作用，可能从中找到新的治疗靶点，从而优化GDF 治疗。