GM、 G 试验对机械通气并发肺曲霉菌感染的诊断价值

林少刚, 林群英, 陈国欢, 郭建斌, 林伟华

(1.莆田学院附属医院 呼吸与危重症医学科， 福建 莆田 351100 2.莆田学院附属医院 急诊科， 福建 莆田 351100)

0 引言

侵袭性肺真菌感染是指真菌侵犯人体的气管、 支气管以及肺部组织, 使气道粘膜与肺部组织出现炎症, 并导致肺部组织出现一系列病理损害的肺部疾病。 当曲霉菌侵袭肺组织和支气管时, 称为侵袭性肺曲霉菌病( invasive pulmonary aspergillosis, IPA)。 近年来, 随着机械通气在临床的广泛应用, 曲霉菌的感染率也随之不断上升[1], IPA 在呼吸衰竭的患者中有较高的发病率和死亡率。 研究表明, 无任何基础疾病的IPA患者发病率约占20%[2]。 由于糖皮质激素的长期使用, 慢性阻塞性肺疾病并发呼吸衰竭继发IPA 的发病率不断升高[3]。 目前诊断IPA 主要是根据肺组织病理和痰液的真菌培养结果, 由于病理检查的有创性, 真菌培养的阳性率低、 时间长, 这些检测方法都具有一定的局限性。 临床上常采用半乳甘露聚糖( galactomannan, GM) 试验和(1,3)-β-D 葡聚糖试验(G 试验)进行曲霉菌检测。 本研究运用肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid, BALF)GM 试验、 血清GM 试验、 血清G 试验、 真菌培养等方法检测机械通气患者的曲霉菌感染情况, 观察并比较不同检测方法的特点, 以期为早期曲霉菌感染患者的诊断提供一定的指导。

1 资料与方法

1.1 研究对象

选取2016 年3 月—2019 年3 月入住莆田学院附属医院(我院) 呼吸与危重症医学科机械通气的患者200 例作为研究对象。 本研究不同的检测都获得患者和家属的知情同意。

1.2 诊断标准

在欧洲癌症研究治疗组织和真菌病研究组制定的诊断标准[4]的基础上, 结合国内《 重症患者侵袭性真菌感染诊断与治疗指南(2007)》 的标准[5], IPA 患者需符合宿主因素、 微生物标准、 临床标准及组织病理学等资料。 排除HIV感染、 恶性血液病及肿瘤、 器官移植、 造血干细胞移植、 自身免疫性疾病、 粒细胞缺乏、 近1 周内使用如哌拉西林他唑巴坦等青霉素来源的半合成药的患者。

1.3 实验分组

病例分为IPA 组( 确诊和临床诊断为IPA)患者92 例, 非IPA 组(对照组) 患者88 例, 拟诊20 例被剔除, 临床拟诊病例不纳入分组。

1.4 样本采集

1.4.1 BALF

按照《肺部感染性疾病支气管肺泡灌洗病原体检测中国专家共识(2017 年版)》[6]进行操作。 真菌治疗前进行术前评估, 排除禁忌症, 严格按照适应症进行, 术中进行心电监护和血氧饱和度监测, 用2%的利多卡因1 ～2 mL 行灌洗肺段局部麻醉, 根据胸部CT 将支气管镜嵌顿于病变亚段支气管, 经操作孔道注入37℃无菌生理盐水20～50 mL, 以支气管腔不塌陷为条件的负压下( 低于13.3 kPa) 回收BALF, 回收第2 管BALF, 留取5～10 mL 待检测。

1.4.2 血清

真菌治疗前用真空采血管采集患者血液3 mL, 用4 000 r/ min 离心分离血清, 离心10 min后, 将上清液放置于6℃冰箱, 以备使用。

1.5 检测方法

1.5.1 GM 试验

通过双抗体夹心酶联免疫吸附试验检测标本的GM 值, 将标本匀浆处理后, 把300 μL 血清或BALF 与100 μL 处理液混合均匀, 放置于水浴锅内, 温度调至100℃水浴3 min 后, 离心机10 000 r/ min 离心10 min； 再分别将50 μL 上清液和结合液用移液枪加入孔板内, 采用封口膜将孔板封口, 并置于37℃水浴锅中水浴1.5 h, 将封口膜去除, 反复多次清洗孔板, 并拍板5 次, 去除掉未结合物, 加入200 μL 的显色液, 避光孵育0.5 h 后再加入100 μL 终止液, 将酶标仪上的波长调至450 nm, 检测标本。 根据公式Index =样本A 值/ 阈值对照血清A 均值, 把样本A 值换算成系数I 值。 根据试剂盒标准公式换算, GM值≥0.5 认为是阳性。

1.5.2 G 试验

使用MB-80 微生物快速动态检测系统与北京金山川科技发展有限公司的(1,3)-β-D 葡聚糖检测试剂盒对标本进行动态光度法检测。 步骤如下： 将900 μL 样品处理液+100 μL 血清充分振荡使其混合均匀, 将水浴锅温度调至70℃加热10 min, 放置于冷却槽中冷却5 min。 将600 μL 主剂溶解液+主剂充分溶解, 并振荡使其混合均匀以待使用。 取出100 μL 冷却好的处理液+主剂100 μL 置于常温的平底试管内, 振荡混合均匀,反应结束后, 上机检测标本, 计算标本内(1,3)-β-D 葡聚糖含量。 G 试验的阳性标准为检测值＞100 pg / mL。

1.5.3 联合检测

将BALF GM 试验、 血清GM 试验、 血清G试验方法联合检测。

1.6 统计学处理

用SPSS 26.0 统计学软件对数据进行分析,符合正态分布的计量数据以¯x±s 表示, 两组间均数的比较采用t 检验； 不符合正态分布的计量资料以M(P25, P75) 表示, 两组间比较采用两样本秩和检验； 计数资料以N(%)表示, 采用卡方检验进行比较。 检验水平为0.05。

2 结果

2.1 一般资料

按样本量估计结果选取200 例患者纳入研究, 其中20 例被剔除( 临床拟诊病例不纳入研究)： 5 例患者未行BALF GM 试验检测, 6 例患者死亡, 5 例患者未行血清GM 试验检测, 4 例患者资料不全； 最终纳入本次研究的患者共有180 例。 入选患者中, 男性94 例, 女性86 例；年龄38 ～91 岁, 平均年龄(63.75 ± 13.72) 岁。IPA 组与非IPA 组一般资料比较, 差异无统计学意义, 见表1。

表1 两组患者一般资料比较

2.2 GM 试验、 G 试验检测结果

IPA 组患者BALF GM、 血清GM 试验检测水平明显高于非IPA 组BALF GM、 血清GM 试验检测水平(P＜0.05), IPA 组患者BALF GM 试验检测水平明显高于血清GM 试验检测水平( P ＜0.05), 差异有明显统计学意义。 IPA 组患者血清G 试验检测水平与非IPA 组G 试验检测水平差异无统计学意义(P＞0.05)。 见表2。

表2 两组患者BALF 及血清GM、 血清G 试验水平比较(n, ¯x±s)

2.3 敏感性、 特异性、 阳性预测值(PPV)、 阴性预测值(NPV)、 符合率

92 例IPA 患者中, BALF GM、 血清GM、 血清G 试验的敏感性、 特异性、 PPV、 NPV、 符合率低于联合检测的敏感性、 特异性、 PPV、NPV、 符合率, 差异有统计学意义( P ＜0.05)。血清G 试验的敏感性、 特异性低于BALF GM、血清GM 试验的敏感性、 特异性； 血清GM 试验的敏感性、 特异性低于BALF GM 的敏感性、 特异性, 差异有统计学意义(P＜0.05)。 见表3。

3 讨论

既往观点认为, 免疫功能缺陷患者易发生IPA, 尤其以长期服用免疫抑制剂和血液系统肿瘤患者最为常见。 近年来, 越来越多的研究表明, IPA 在免疫功能正常的患者中的发病率有上升趋势[7]。 Garbino J 等研究表明, 肺部基础疾病、 机械通气的广泛应用都是IPA 的危险因素[8]。 本研究对象是呼吸与危重症医学科机械通气的患者, 由于气管插管和机械通气, 使呼吸道粘膜等正常生理屏障被破坏, 而患者肺部的基础疾病, 使患者呼吸幅度变浅变快, 加上广谱抗生素及质子泵抑制剂等药物的长期使用, 导致院内环境的致病真菌容易通过机械通气管道侵入肺组织深部及血液, 最终导致IPA。

表3 BALF GM、 血清GM 试验、 血清G 试验敏感性、 特异性、 PPV、 NPV、 符合率 %

《侵袭性肺部真菌感染的诊断标准与治疗原则(草案)》[9]中提出, 肺部真菌感染通过危险因素、 临床特征、 微生物学及组织病理学等方面确诊。 病理学是诊断IPA 的“金标准”, 但是作为一种有创检查, 肺部取材容易出现并发症, 影响患者的肺功能。 真菌培养可以确诊IPA, 但是真菌培养阳性率不高, 并且存在假阳性, 多次培养出同一病菌方能确定为致病菌, 较长的诊断周期可能使患者失去最佳的治疗时机。 影像学IPA 表现特异性不高, 因此, 本文通过GM 试验、 G 试验对IPA 进行早期诊断。

GM 作为细胞壁上的一种多糖成分, 当人体遭受到外来曲霉菌的侵袭时, GM 会在血液与体液内释放, 检测血液和体液( BALF) GM 可以用于早期诊断IPA。 本研究中IPA 组患者BALF GM试验检测水平明显高于非IPA 组BALF GM 试验检测水平(P＜0.05), IPA 组患者血清GM 试验检测水平明显高于非IPA 组血清GM 试验检测水平(P＜0.05)。 结果提示GM 试验是一种快速、 高效的诊断方法, 对IPA 的早期诊断有重要意义。IPA 组患者BALF GM 试验检测水平明显高于IPA组血清GM 试验检测水平(P＜0.05), 原因主要是真菌菌丝首先侵犯IPA 患者的肺组织, 之后才通过毛细血管屏障进入血液, IPA 患者血清GM载量明显低于肺组织, 而且具有一定的滞后性。因此, 在诊断IPA 方面, BALF GM 试验明显优于血清GM 试验, 具有更高的诊断价值。

(1,3)-β-D 葡聚糖是一种抗原成分, 留存于真菌细胞的细胞壁中。 当真菌侵袭人体时, (1,3)-β-D 葡聚糖会迅速释放出来, 使(1,3)-β-D 葡聚糖在血液、 体液中的浓度升高。 G 试验可以快速检测血清中(1,3)-β-D 葡聚糖的含量, 对IPA的诊断具有一定的参考价值。 马清等研究表明,侵袭性肺真菌感染组患者BALF、 血清G 试验检测值明显高于非真菌感染组, 具有统计学意义[9]。 这与本文的检测结果不完全相符, 本研究中, 两组患者血清G 试验检测水平差异无明显统计学意义。 原因可能是G 试验是一种检测广谱真菌的项目, 对不同种类、 不同部位真菌感染检测的敏感性、 特异性具有一定的差异性。

本研究对比BALF GM、 血清GM、 血清G 试验检测诊断效率, BALF GM 试验敏感性、 特异性、 PPV、 NPV、 符合率明显高于血清GM 试验的相应指标( 60.87% 与43.48%, 65.91% 与56.82%, 65.12% 与 51.28%, 61.70% 与49.02%, 63.33% 与50.00%)； 这 与Guo 等 的Meta 分析结果一致, BALF GM 检测准确率高于血清GM 检测[10]。 但Guo 等的Meta 分析结果中BALF GM 试验的敏感性与特异性均大于90.00%。 本研究结果中BALF GM 试验的敏感性为60.87%、 特异性为65.91%, 这可能与GM 阈值大小有关。 本研究血清G 试验的敏感性、 特异性明显低于BALF GM、 血清GM 试验的敏感性、特异性, 这与马清等[11]的研究结果不同。 同时,本研究中发现IPA 组与非IPA 组血清G 试验的检验水平差异无明显统计学意义。 因此, G 试验对IPA 的诊断具有一定的不确定性, 可能需要进一步结合其他临床资料, 这有待于进一步的研究探讨。

当然, 本研究也存在着一定的局限性,BALF GM 试验结果可能受到样本的采集部位、灌洗位置及生理盐水回收量的影响, BALF GM可能受到患者某些潜在疾病(如过敏性支气管肺曲霉菌病)的影响, BALF GM 采集的时机可能在真菌侵犯血管、 气道、 肺上皮的不同阶段, 患者在疾病发展过程中可能食用污染的谷物或者牛奶等高蛋白食物。 这将是今后研究中需要进一步改进的方向。

综上所述, BALF GM、 血清GM 试验可为机械通气患者是否感染曲霉菌提供早期的诊断依据。 在早期诊断IPA 的检测方法中, BALF GM试验明显优于血清GM 试验； 血清G 试验诊断机械通气患者是否感染曲霉菌时, 需结合其他临床资料。 无论是BALF GM、 血清GM、 血清G 试验, 还是真菌培养, 都存在着假阳性与假阴性,在疑似IPA 的机械通气患者的治疗过程中, 在传统真菌培养法的基础上, 应及时检测BALF GM、血清GM, 一方面可以使机械通气的IPA 患者得到及时的抗曲霉菌治疗, 同时也可以减少抗曲霉药物的滥用, 以更好地造福患者。