肺泡灌洗液宏基因组测序在儿童重症肺炎支原体肺炎混合感染中的诊断价值

马彩霞 陈镜龙 陆 泳 张明智 王立波 陆爱珍

1.复旦大学附属中山医院青浦分院儿科（上海 201700）；2.复旦大学附属儿科医院（上海 201102）

肺炎支原体肺炎（Mycoplasma pneumoniaepneumonia，MPP）在儿童发病率逐年增高，近年来肺炎支原体（Mycoplasma pneumoniae，MP）引起的危重病例不断增多[1-3]。在危重病例中，混合感染发生率可达30%～60%，混合感染的病原体有细菌、病毒和其他非典型病原体[4-5]。因此，早期诊断混合感染对治疗重症MPP、改善其预后有重要意义。近年来，基于宏基因组的二代测序（metagenomics nextgeneration sequencing，mNGS）技术作为病原微生物的快速检测手段，在重症和疑难病例的病原学诊断中发挥了重要作用。本文采用mNGS技术检测儿童重症MPP患儿肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）中的病原微生物，探讨mNGS技术对儿童重症MPP混合感染的诊断价值。

1 对象和方法

1.1 研究对象

2019年6月至2019年12月期间复旦大学附属中山医院青浦分院儿科和复旦大学附属儿科医院因重症MPP需要肺泡灌洗治疗的患儿为研究对象。所有入选患儿血清MP-IgM阳性或鼻咽分泌物MP-DNA阳性，且临床符合重症MPP诊断标准[6-7]。①明显气促或心动过速。判断标准：＜ 1岁，呼吸频率≥50次/min，心率≥150次/min；1～ 5岁，呼吸频率≥ 40次/min，心率≥140次/min；＞ 5岁，呼吸频率≥30次/min，心率≥120次/min，伴或不伴动脉血压下降（收缩压≤75 mmHg）、三凹征及发绀等。②规范应用大环内酯类药物1周以上无效，腋温≥ 38.5 ℃ 或肺部影像学无好转甚至进展，或持续发热时间≥10天。③胸部影像学表现为大片状致密影，占据一个肺段或肺叶以上范围，可累及单叶或多叶病变。④出现胸腔积液、肺不张、肺坏死/肺脓肿等肺内并发症。⑤出现严重低氧血症（PaO2＜60 mmHg）或合并其他系统严重损害（中枢神经系统感染、心力衰竭、心肌炎、消化道出血、明显电解质/酸碱平衡紊乱等）。符合上述标准中前3条中的任意2条和/或后2条中任意1条诊断为重症MPP。排除标准：①患有慢性基础性疾病。②近期使用免疫制剂的患者。③T-SPOT阳性的患儿。收集研究对象的一般人口学资料、临床资料和影像学资料。本研究得到复旦大学青浦中山医院和复旦大学附属儿科医院科研伦理委员会批准。

1.2 方法

1.2.1 支气管肺泡灌洗和BALF收集 重症MPP是支气管肺泡灌洗的适应证[8]。支气管镜检查由经验丰富的医师操作。在咪达唑仑静脉镇静下，经鼻进镜，使用2%的利多卡因气道黏膜表面麻醉。到达病变部位时，将支气管镜末端楔入病变段或肺叶，经气管镜工作通道注入温热生理盐水（1 mL/kg）进行灌洗，灌洗后立刻抽吸，抽吸压力为100 mmHg，将回吸收的BALF吸收至痰液收集器中[9]。留取收集到的BALF 3 mL置于-80 ℃冰箱保存，待送检迪飞医学进行mNGS病原检测。剩余BALF常规送检验科进行呼吸道病原抗原9项检测（呼吸道合胞病毒、腺病毒、副流感病毒1-3型、流感病毒A、B型、偏肺病毒、鼻病毒、沙眼衣原体DNA和肺炎支原体DNA）、BALF培养、真菌GM试验及抗酸染色涂片。

1.2.2 mGNS检测 收集到的BALF行mNGS病原微生物基因检测。核酸抽提按照TIANamp Micro DNA Kit（天根生物，北京）试剂盒说明书进行。分别采用Qubit 2.0（ThermoFisher，美国）和NanoDrop（Thermo Fisher，美国）对核酸进行定量和质量评估。文库构建按照KAPA Hyper Prep kit（KAPA Biosystems，美国）试剂盒说明书进行。采用Agilent 2100 Bioanalyzer（安捷伦，美国）进行文库质控，最终在Illumina NextSeq 550 Dx（Illumina，美国）平台上进行75 bp单端测序。高通量测序的原始数据通过去除低质量碱基，接头序列，重复序列和短序列（＜36 bp）获得优质数据。每例样本进行不少于20M reads的高通量测序。优质数据通过Bowtie 2比对人参考基因组去除人源宿主序列。剩余未比对到人参考基因组的数据通过比对微生物数据库进行鉴定。迪感康微生物数据库覆盖细菌、真菌、支原体、病毒和寄生虫，基因组序列来源于National Center Biotechnology Information （ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/）。mNGS检测的阳性标准：①对于分枝杆菌、诺卡菌和嗜肺军团菌，mNGS检测到的菌种特异性序列数≥1为阳性。②对于细菌（不包括分枝杆菌、诺卡菌和嗜肺军团菌）、真菌、支原体、病毒和寄生虫，mNGS检测到不重叠的特异性序列数≥3为阳性。

1.3 统计学分析

采用SPSS 18.0软件对数据进行分析，非正态分布计量资料以中位数（四分位数范围）表示。计数资料以例数（百分比）表示，组间比较采用χ2检验。两变量间相关性分析采用Spearman秩相关检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般情况

共纳入47例重症MPP患儿，其中5例由复旦大学附属中山医院青浦分院儿科转入复旦大学附属儿科医院呼吸科。纳入患儿中，男23例、女24例，中位年龄58.0（38.0～81.0）月。影像学有肺实变/不张表现的患儿31例，胸腔积液10例，伴有纵隔积气2例。气管镜下有明显黏膜坏死、通气不良或者痰栓形成的患儿28例。见表1、图1。

表1 重症MPP患儿临床特点

图1 气管镜下病变

2.2 病原检测结果

47例患儿BALF传统病原检测中，细菌培养均为阴性；抗酸染色均为阴性；传统病原检测中所有患儿MP-PCR检测阳性；有2例检测出混合感染，分别为鼻病毒和腺病毒，混合感染率为4.3%。mNGS检测中，所有患儿Mp检测均为阳性，23例检测出混合感染，mNGS的混合感染检出率为48.9%，显著高于传统病原检测，差异有统计学意义（χ2=24.03，P＜0.001）。

对于MP检测，传统检测中PCR方法与mNGS检测阳性结果完全相符。传统PCR的MP拷贝数1×106（1×104～1×107）与mNGS中的MP read读数5 408（211～19 739）存在正相关关系（r=0.439，P=0.002）。

mNGS检测出的23例混合感染中，病原微生物前3位分别为腺病毒7型11例（23.4%）、肺炎链球菌5例、脓肿分枝杆菌5例。见表2。

表2 混合感染中病原微生物组成

3 讨论

临床上重症MPP虽经规范大环内酯类抗生素抗MP治疗，但临床症状及肺部影像学改善不明显，常常出现肺不张、胸腔积液，甚至发生闭塞性细支气管炎、急性呼吸窘迫综合征，或伴有血液系统、皮肤系统、胃肠道系统等肺外并发症[6]，病程迁延，影响患儿生活质量。大环内酯类抗生素是治疗MP的传统手段，但重症病例单纯应用大环内酯类抗生素治疗效果不佳[10-11]。研究表明，MP黏附于气道上皮细胞表面后，会反复持续损伤气道纤毛柱状上皮，造成纤毛数量减少和结构异常，导致黏液纤毛系统清除功能受损，不能有效清除病原，致使肺部感染迁延不愈，容易同时合并细菌或病毒等感染[12-13]，是导致重症病例单纯应用大环内酯类抗生素效果不佳的重要原因。因此，诊断和控制混合感染是治疗重症MPP的重要途径。

传统微生物培养方法阳性率仅为10%左右，而传统PCR检测虽然在灵敏度、特异度和检测时效上明显优于培养法，但因为PCR法基于已知病原菌的基因组序列，所能提供的信息有限，依然不能解决临床诊断阳性率低的问题[14]。因此，对于混合感染和未知致病微生物的检测是传统检测方法无法逾越的障碍。无偏倚的mNGS能克服传统病原检测的局限性，进行病原体广谱检测，包括细菌、病毒、真菌和寄生虫[15]。本研究发现，在MP诊断方面，mNGS和传统PCR方法完全一致，阳性率均为100%，传统PCR的MP拷贝数与mNGS中的MP读数呈正相关关系，考虑主要是检测方法原理相似，两者都采用了基因扩增技术。而在混合感染诊断方面，mNGS混合感染检出率（48.9%），显著高于常规病原检测方法（4.3%），提示mNGS在混合感染的病原微生物诊断方面有强大优势。相关研究发现，mNGS技术可以早期确定重症肺炎患者的病原体，指导抗菌药物的使用，从而显著降低重症肺炎患儿的28天和90天病死率[16]。

相关研究回顾性分析难治性MPP患儿的病原体构成特征，对18例患儿的BALF采用mNGS进行细菌检测，综合临床特征判断18例患儿的其他细菌检出结果为阴性，得出难治性MPP患儿混合细菌感染很少见的结论[17]。本研究发现，重症MPP患儿的BALF中存在混合细菌，肺炎链球菌和脓肿分枝杆菌是检出率较高的两种菌，与上述研究并不一致，考虑有两方面原因。首先，BALF检测例数不一致；其次，对BALF mNGS结果判读不一致，相关研究对BALF mNGS的结果判读综合临床表现和传统培养方法，而 本研究客观呈现mNGS的检测结果，未掺入主观判 断。

本研究经BALF mNGS检测发现，在重症MPP患儿中，合并11例腺病毒7型感染患儿；而常规病原检测仅检出1例腺病毒抗原（弱阳性）。提示BALF mNGS在合并病毒感染检测方面存有优势。病毒培养困难，常规抗原检测阳性率低，更不能进行具体分型。mNGS可以检出腺病毒的具体基因分型，从而提供更好的临床指导和预后判断。HAdV-7 B型是 2019年我国南方发病地区主要流行株，多引起重症肺炎，导致闭塞性细支气管炎等多种后遗症[18]。另外，mNGS检测出的病毒读数可以为评估病毒载量提供依据。

本研究也存在局限性。首先，病例数有限，本研究仅对47例BALF进行了mNGS的检测；其次，未对临床指标进行标准化，未结合临床对mNGS检测到的微生物进行筛选，在判定混合感染的客观性和准确性上可能存在一些不足。

综上，在儿童重症MPP中，BALF mNGS相比传统方法有更高的混合感染检出率，尤其是对合并病毒感染的检测更具优势，能早期进行病毒分型和病毒载量分析，为临床提供诊断、治疗和预后判断依据。通过BALF mNGS的检测，发现儿童重症MPP合并人腺病毒7型感染的比例较高，而腺病毒7型是引起重症肺炎和后遗症的重要病毒类型，该发现为进一步阐明重症MPP的发病机制和预后判断提供了依据。