去铁胺在甲基汞诱导细胞铁死亡中的作用及其机制

刘婷婷，董丽华，张宇，徐伟，朱海涛，李芳，王苏华，邢光伟，陆荣柱

(1.江苏大学医学院，江苏 镇江 212013；2.常州市第一人民医院检验科，江苏 常州 213000；3.江苏大学附属医院医学影像科，江苏 镇江 212001)

汞是一种天然存在的金属元素，可分为无机汞和有机汞[1]。水生微生物通过促进无机汞的甲基化使其成为毒性更大的甲基汞而更易在食物链中产生生物富集[2]。人类主要通过食用含甲基汞的鱼类而暴露于甲基汞中[3]。中枢神经系统是甲基汞毒性的主要靶器官[4]，近来甲基汞致肝脏和肾脏等非神经系统的损伤也逐渐引起关注[5-6]。铁死亡是一种新命名的以铁依赖性脂质过氧化为特征的程序性死亡方式[7]；其广泛参与神经[8]及肝脏系统的缺血缺氧损伤[9]，且多与谷胱甘肽过氧化物酶4(glutathione peroxidase 4,GPx4)表达下降有关[10]。但甲基汞与铁死亡之间的关系尚不明确。Fe2+作为脯氨酸羟化酶活性的重要辅因子，在缺氧诱导因子-1α(hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)的降解中起重要作用。HIF-1α是一种普遍存在于哺乳动物体内，为适应低氧环境而表达的转录调节因子。前期研究表明甲基汞的毒性与脯氨酸羟化酶活性增强进而促进HIF-1α降解有关[11]，由此推测甲基汞增强脯氨酸羟化酶的活性可能与Fe2+负载有关。去铁胺可以抑制甲基汞的氧化毒性[12]，其作为铁离子螯合剂可抑制铁死亡[13-14]，同时去铁胺可抑制脯氨酸羟化酶的活性从而抑制HIF-1α降解[15]，但去铁胺拮抗甲基汞的毒性效应是否是通过抑制铁死亡而实现的尚不明确。因此，本研究一方面探讨甲基汞的毒性与铁死亡之间的关系，另一方面选用去铁胺作为铁死亡抑制剂，探讨其在甲基汞致细胞损伤中的作用和相关分子信号机制。

1 材料与方法

1.1 细胞与试剂

大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤PC12细胞系和正常大鼠肝BRL细胞购自中国科学院细胞生物学研究所；甲基汞、二甲基亚砜、MTT(美国Sigma公司)；DMEM高糖培养基(美国HyClone公司)；胎牛血清(美国Gibco公司)；兔抗HIF-1α单克隆抗体(美国ImmunoWay公司)；兔抗GPx4单克隆抗体、去铁胺试剂(英国Abcam公司)；羊抗兔二抗、β-肌动蛋白(美国Santa Cruz公司)；蛋白浓度相关试剂盒、抗体稀释液、上下分离胶配置试剂盒(碧云天试剂公司)。

1.2 细胞培养

PC12细胞和BRL细胞置于-80 ℃冰箱保存，进行细胞实验时，取出置于37 ℃水浴锅中快速摇动复苏，完全融化后转移至含10%胎牛血清的高糖培养基的培养皿中，并置于37 ℃、含5%CO2的细胞培养箱进行培养；隔2 d用胰酶进行消化传代并继续培养；待细胞均匀铺满孔底75%～85%时进行后续实验。传代次数不超过10代。

1.3 细胞分组和处理

取PC12细胞和BRL细胞以5 000个/孔密度接种于96孔板，以50 000个/孔接种于6孔板，待细胞均匀铺满孔底75%～85%时进行后续实验。

细胞分组：对照组用含10%胎牛血清的高糖培养基处理细胞0.5 h；实验组用含不同浓度甲基汞(1.0、2.5、5.0、10.0 μmol/L)培养基处理细胞0.5 h。用MTT法检测细胞活力，蛋白印迹法检测GPx4蛋白表达。筛选最适浓度甲基汞进行后续实验。

1.4 MTT法检测细胞活力

取“1.3”处理后细胞；弃培养基，每孔加入100 μL含0.05 g/mL MTT溶液的培养基，继续培养4 h；弃培养基，加入150 μL二甲基亚砜溶液，避光并充分振荡混匀；利用酶标仪检测490 nm波长处光密度(D)值，并计算细胞活力。细胞活力=(实验组D值-空白组D值)/(对照孔D值-空白组D值)。

1.5 蛋白印迹实验检测HIF-1α及GPx4蛋白表达

收集“1.3”处理后细胞，用预冷PBS洗涤3次，用含1% PMSF的RIPA裂解缓冲液冰上裂解10～15 min；收集至EP管，4 ℃以12 000×g离心15 min，收集上清液；用BCA蛋白分析试剂盒测定蛋白质浓度；加入5×上样缓冲液，煮沸5 min；80 V经SDS-PAGE分离蛋白；300 mA 90 min转至PVDF膜；5%脱脂牛奶封闭2 h；TBST缓冲液洗膜3次；加入对应的一抗稀释液(HIF-1α和GPx4为1 ∶1 000，β-肌动蛋白为1 ∶10 000，稀释液为5%脱脂牛奶)，4 ℃孵育过夜；TBST洗膜3次，加入HRP标记的羊抗兔二抗(TBST稀释，1 ∶10 000)室温孵育1 h；TBST洗膜3次；将PVDF膜置于凝胶成像系统，加入一定的曝光剂进行曝光、成像分析，Lane 1D软件用于灰度分析。

1.6 去铁胺预处理对细胞活力及GPx4和HIF-1α蛋白表达的影响

取PC12细胞和BRL细胞以5 000个/孔密度接种于96孔板中，以50 000个/孔接种于6孔板，待细胞均匀铺满孔底75%～85%时进行后续实验。

细胞分组：对照组用含10%胎牛血清的高糖培养基处理细胞 6.5 h；去铁胺+甲基汞组分别用0、50、100、200、400 μmol/L去铁胺预处理6 h，弃培养液，加10.0 μmol/L甲基汞继续培养0.5 h。用MTT法分析细胞活力，蛋白印迹法检测GPx4和HIF-1α蛋白表达，具体方法同“1.4”和“1.5”。

1.7 统计学分析

2 结果

2.1 甲基汞降低PC12细胞和BRL细胞活力

MTT结果显示，与对照组相比，在PC12细胞中，5.0 μmol/L和10.0 μmol/L甲基汞处理后，细胞活力明显降低(q=5.754、9.761，P均<0.05)；与5.0 μmol/L甲基汞组相比，10.0 μmol/L甲基汞组细胞活力下降更显著(q=4.077，P<0.05)，呈一定的剂量依赖性。在BRL细胞中，10.0 μmol/L甲基汞组细胞活力较对照组明显降低(q=10.67，P<0.05)。因此，选择10.0 μmol/L甲基汞进行后续实验。见图1。

a:P<0.05，与对照组比较;b:P<0.05,与5.0 μmol/L比较图1 MTT法检测不同浓度甲基汞处理后两种细胞活力的变化

2.2 甲基汞降低PC12细胞和BRL细胞中GPx4蛋白表达

免疫印迹结果显示，与对照组相比，在PC12细胞中，2.5、5.0、和10.0 μmol/L甲基汞处理后，GPx4蛋白表达明显降低(q=4.220、5.601、6.817，P均<0.05)；在BRL细胞中，5.0和10.0 μmol/L甲基汞组GPx4蛋白表达明显降低(q=3.618、3.955，P均<0.05)。见图2。

a:P<0.05，与对照组比较图2 免疫印迹法检测不同浓度甲基汞处理后两株细胞中GPx4蛋白表达

2.3 去铁胺预处理逆转甲基汞致PC12细胞和BRL细胞中GPx4蛋白表达降低

免疫印迹结果显示，与对照组相比，0 μmol/L去铁胺+甲基汞组PC12细胞和BRL细胞中GPx4蛋白表达明显降低(q=3.3、2.958，P均<0.05)；与0 μmol/L去铁胺+甲基汞组相比，50、100、200和400 μmol/L去铁胺+甲基汞组PC12细胞GPx4蛋白表达明显增加(q=3.614、7.879、7.296、11.50，P均<0.05)；且各浓度间GPx4蛋白表达差异均有统计学意义(P<0.05)，除外100 μmol/L去铁胺+甲基汞组与200 μmol/L去铁胺+甲基汞组中GPx4蛋白表达无统计学意义(P>0.05)。在BRL细胞中，400 μmol/L去铁胺+甲基汞组中GPx4蛋白表达较0 μmol/L去铁胺+甲基汞组明显增加(q=3.390，P<0.05)。见图3。

2.4 去铁胺预处理逆转甲基汞致PC12细胞和BRL细胞中HIF-1α蛋白表达降低

免疫印迹结果显示，与对照组相比，0 μmol/L去铁胺+甲基汞组PC12细胞和BRL细胞中HIF-1α蛋白表达明显降低(q=2.932、3.044，P均<0.05)。与0 μmol/L去铁胺+甲基汞组相比，50、100、200和400 μmol/L去铁胺+甲基汞组PC12细胞中HIF-1α蛋白表达均明显增加(P均<0.05)；与50 μmol/L去铁胺+甲基汞组相比，400 μmol/L去铁胺+甲基汞组中HIF-1α蛋白表达明显增加(q=3.900，P<0.05)。100、200和400 μmol/L去铁胺+甲基汞组BRL细胞中HIF-1α蛋白表达明显高于0 μmol/L去铁胺+甲基汞组(q=2.819、2.908、3.389，P均<0.05)。见图4。

a:P<0.05，与对照组比较；b:P<0.05，与0 μmol/L去铁胺+甲基汞组比较；c：P<0.05，与50 μmol/L去铁胺+甲基汞组比较；d：P<0.05，与100 μmol/L去铁胺+甲基汞组比较；e：P<0.05，与200 μmol/L去铁胺+甲基汞组比较图3 免疫印迹法检测不同浓度去铁胺预处理后细胞中GPx4蛋白表达

a:P<0.05，与对照组比较，b:P<0.05，与0 μmol/L去铁胺+甲基汞组比较；c:P<0.05，与50 μmol/L去铁胺+甲基汞组比较；图4 免疫印迹法检测不同浓度去铁胺预处理后细胞中HIF-1α蛋白表达

2.5 去铁胺预处理逆转甲基汞致PC12细胞和BRL细胞活力降低

与对照组相比，0 μmol/L去铁胺+甲基汞组中PC12细胞和BRL细胞活力明显降低(q=8.675、5.30，P均<0.05)。与0 μmol/L去铁胺+甲基汞组相比，400 μmol/L去铁胺+甲基汞组PC12细胞活力明显增加(q=3.607，P<0.05)，200 μmol/L去铁胺+甲基汞组BRL细胞活力明显增加(q=2.781，P<0.05)。见图5。

a:P<0.05，与对照组比较，b:P<0.05，与0 μmol/L去铁胺+甲基汞组比较图5 MTT法检测不同浓度去铁胺预处理后细胞活性变化

3 讨论

本研究采用神经元样PC12作为神经元模型，利用大鼠肝BRL细胞作为非神经元模型。实验结果表明，甲基汞浓度为5.0和10.0 μmol/L时，PC12细胞活力明显降低，甲基汞浓度为10.0 μmol/L时，BRL细胞活力明显降低，表明神经元细胞模型可能对甲基汞毒性更加敏感，这与Miura等[16]发现相一致，其机制可能与汞更容易蓄积于中枢神经系统[17]，也可能与肝脏系统较强大的排泄作用及促进甲基汞的去甲基化作用有关[18]。已有研究发现多种药物和化学毒物毒性机制涉及铁死亡，例如，铁死亡在铝致神经元死亡中起到重要作用，其机制主要涉及谷胱甘肽表达下调及活性氧生成[14]。甲基汞毒性主要与谷胱甘肽的耗竭、活性氧的生成等进而造成机体氧化应激损伤有关，且该损伤可能由Fe2+所介导[12]。GPx4作为调控氧化应激损伤的重要调控因子，亦是铁死亡的关键调控基因，并且对神经组织平衡的维持具有重要作用[19]。中枢神经是甲基汞最重要的靶器官，但甲基汞的细胞毒性是否与调控GPx4表达进而诱导铁死亡相关仍不明确。在本实验中，甲基汞浓度为2.5 μmol/L时，PC12细胞中GPx4蛋白表达明显降低；在BRL细胞中，甲基汞浓度为5 μmol/L 时，GPx4蛋白表达降低。PC12细胞中GPx4蛋白对甲基汞浓度更加敏感，可能与肝脏具有较强大的抗氧化应激损伤有关，也提示PC12细胞对甲基汞毒性更加敏感的机制可能与甲基汞作用后GPx4蛋白下降更明显有关，同时提示甲基汞的毒性可能与其诱导铁死亡相关。

去铁胺作为一种传统的铁螯合剂，在麦芽酚铝致PC12细胞铁死亡中起重要拮抗作用，其机制可能与去铁胺降低细胞内铁离子含量和增加细胞抗氧化损伤能力而抑制铁死亡有关[14]。本实验中选用不同浓度去铁胺进行预处理后，在PC12细胞和BRL细胞中，去铁胺浓度分别为400、200 μmol/L时可以拮抗甲基汞的毒性，一方面表明去铁胺为一种有效的化学毒物致损伤的拮抗剂，另一方面表明在神经元细胞中拮抗甲基汞毒性需要较高浓度的去铁胺，说明甲基汞致神经细胞损伤后可能较难逆转。GPx4蛋白表达下降是铁死亡发生的关键事件之一，在急性肾衰模型中，利用铁螯合剂上调GPx4蛋白可以抑制铁死亡诱导剂所致的细胞死亡[19]。去铁胺作为一种铁死亡拮抗剂，能够减轻氧化应激损伤，增加多巴胺活性，从而改善运动神经症状。本研究发现，去铁胺预处理后，除200 μmol/L与100 μmol/L比较GPx4蛋白表达增加无统计学意义外，其他浓度组间GPx4蛋白表达差异均有统计学意义，表明在50～100 μmol/L以及200～400 μmol/L范围内呈一定的浓度依赖性；在BRL细胞中，仅400 μmol/L去铁胺处理时GPx4表达增加，未呈一定的浓度依赖性，一方面提示去铁胺拮抗甲基汞毒性可能与增加GPx4蛋白表达进而抑制铁死亡有关，另一方面提示GPx4蛋白表达增加在去铁胺拮抗甲基汞致神经细胞损伤中更为敏感，且在一定浓度范围内呈一定的剂量依赖性。

在氧化应激的体外模型中，铁螯合剂的保护作用与激活HIF-1相关，且调控HIF-1α降解的关键酶——脯氨酸羟化酶的抑制剂在拮抗铁死亡方面亦起重要作用[20]，去铁胺作为铁离子螯合剂，一方面可以抑制铁死亡，另一方面可以抑制HIF-1α降解。本实验发现50、100、200和400 μmol/L去铁胺作用后，PC12细胞中HIF-1α表达增加，且400 μmol/L去铁胺预处理后HIF-1α表达较50 μmol/L显著增加；在BRL细胞中，100、200和400 μmol/L预处理后HIF-1α表达增加。一方面表明HIF-1α上调在去铁胺拮抗甲基汞致铁死亡中可能亦存在着重要作用；另一方面，甲基汞毒性与其损伤线粒体造成机体氧气利用障碍有关，PC12细胞作为神经元，对氧浓度更为敏感[21]，因此去铁胺浓度较低时，PC12细胞中HIF-1α表达上调，以更好地拮抗甲基汞致神经元因氧气利用障碍造成的损伤。

目前关于甲基汞的毒性与铁死亡间关系的研究仍不完善，需要增加一些新的指标，如谷胱甘肽含量测定，细胞内铁离子测定等。同时，虽然本研究表明去铁胺可以通过上调HIF-1α及GPx4起到拮抗甲基汞的毒性作用，但HIF-1α与GPx4的关系亦未完全确定，尚需进一步研究。

综上所述，甲基汞毒性可能与其诱导铁死亡相关，去铁胺作为一种铁螯合剂，具有拮抗甲基汞毒性的效应，其机制可能与上调HIF-1α及GPx4从而抑制铁死亡有关。