归芎益母散对血瘀型胎衣不下奶牛生殖激素和抗氧化能力的影响

黎玉琼，黄雪利，高海慧，梁小军，王胜义，宋晓平，崔东安，赵正伟

（1.宁夏农林科学院动物科学研究所，银川 750002；2.中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所/甘肃省中兽药工程技术研究中心，兰州 730050；3.西北农林科技大学动物医学院，杨凌 712100）

胎衣不下指母畜在娩出胎儿后，胎衣不能在正常时间内（一般是指超过12h）排出[1]。产后胎衣正常分离和排出是一个复杂的过程，涉及胎儿和母体内多种生殖激素协同参与，任何激素水平的改变均有可能影响胎膜排出，导致胎膜滞留[2]。朱永刚等[3]研究发现，胎衣不下患牛血清和胎盘组织中的孕酮、纤维蛋白溶酶原、前列腺素以及雌二醇含量的变化可能参与了胎衣不下的发生和发展过程。其次，奶牛抗氧化能力的降低也是胎衣不下的主要病理因素。姜国均等[4]的研究表明，血浆一氧化氮、丙二醛和谷胱甘肽过氧化物酶活性的变化可能是奶牛胎衣不下发生的原因之一。现有的研究表明，奶牛机体抗氧化酶机能紊乱，随之使雌激素生成减少，导致前列腺素F2α合成下降，子宫收缩力减弱，最终致使胎衣无法正常分离和顺利排出[5,6]。

归芎益母散是中药制剂，治疗奶牛胎衣不下临床效果确切，有效率为85.9%～89.7%[7,8]。靶动物安全性表明，归芎益母散灌服、1次量400g/头、每天1次、连用1～3d的用法与用量防治奶牛胎衣不下是安全的[9]。前期研究表明[8,10]，经归芎益母散治疗后，受试奶牛血浆中 IL-2、TNF-ɑ、NO和6-keto-PGF1ɑ水平升高，而IL-4、IL-10、ET和TXB2水平降低，从而调节Th1/Th2型细胞因子、ET/NO以及TXB2/6-keto-PGF1ɑ趋于平衡，说明归芎益母散不仅可调节机体免疫机能，而且也可对抗内皮功能紊乱和血小板功能紊乱，缓解患牛血瘀状态。本试验在前期研究基础上，通过研究归芎益母散对血瘀型胎衣不下患牛生殖激素和抗氧化能力的影响，探讨其作用机制，旨在为后续研究和临床应用提供科学依据。

1 材料

1．1 药物

归芎益母散：400g/袋，由中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所研制。

益母生化散：250g/袋，购自华秦源（北京）动物药业有限公司（兽药字（2012）010385148）。

1．2 试验动物

荷斯坦牛，经诊断确诊为血瘀型胎衣不下奶牛。

1．3 主要试剂

谷胱甘肽过氧化物酶（Glutathione peroxidase，GSH-Px）试剂盒（LotNo:20170704），超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase SOD）试剂盒（LotNo:20170706），丙二醛（Malondialdehyde，MAD）试剂盒（LotNo:20170705），均购于南京建成生物工程研究所；碘[125I]雌二醇放射免疫分析试剂盒（LotNo:20170520），碘[125I]孕酮放射免疫分析试剂盒（LotNo: 20170520），PGF2αELISA 试剂盒LotNo:GR310884-3），均购于abcam公司。

1．4 主要仪器

HWS26电热恒温水浴锅（上海一恒科学仪器有限公司），SpectraMax® M2e酶标仪（Molecular Devices公司），SBC0060-230V离心机（Select BioProducts公司）。

2 方法

2．1 动物的管理

舍饲饲养，配备卧床，按照高产、中产、低产以及干奶期进行分群，每个圈舍按20%颈夹富余率调整牛群数量，并根据营养需要饲喂不同的全混合日粮，每日饲喂3次，自由采食、饮水。

2．2 动物选择

根据黄雪利[8,10]规定的诊断标准、辨证标准、纳入标准和排除标准等入选标准，选择受试奶牛。

2．3 分组与处理

将40头血瘀型胎衣不下奶牛随机分为4组，分别为归芎益母散高、中、低剂量组和药物对照组，每组10头，另选择10头胎衣正常排出的健康奶牛为空白对照组（不给予药物）。于给药前，将药物用20～25L开水浸泡30min，候温，灌服，每天1次，连续用药1～3d。

2．4 样品制备

于用药后第0天和第7天，颈静脉采血10mL，静置，冷藏过夜，37℃水浴30min，3 500r/min，离心10min，分离血清，-20℃保存备用。

2．5 检测指标

采用黄嘌呤氧化酶法（羟胺法）、二硫对硝基苯甲酸法和硫代巴比妥酸法，检测受试奶牛血清SOD、GSH-Px、MDA的含量；采用放射免疫法测定血清前列腺素（PGF2α）、孕酮和雌二醇的含量，操作步骤按照试剂盒说明书进行。

2．6 数据统计

运用SPSS 20.0软件进行单因素方差分析，数据以“mean±std”表示，P＞0.05为差异不显著，P＜0.05为差异显著，P＜0.01为差异极显著。

3 结果与分析

3．1 归芎益母散对血瘀型胎衣不下奶牛抗氧化能力的影响

给药后第0天，与空白对照组比较，胎衣不下患牛血清GSH-Px、SOD含量低，MDA含量高，差异极显著（P＜0.01）（表1）。给药后第7天，与空白对照组比较，高、中剂量组中奶牛血清GSH-Px、MDA、SOD水平无明显变化（P＞0.05）；与药物对照组比较，高、中剂量组奶牛血清GSH-Px含量高，差异极显著（P＜0.01），低剂量组奶牛血清GSH-Px、MDA、SOD水平无明显变化（P＞0.05）（表2）。

表1 给药后第0天各组奶牛血清氧化指标

表2 给药后第7天各组奶牛氧化指标的变化

3．2 归芎益母散对血瘀型胎衣不下奶牛生殖激素的影响

用药前与空白对照组比较，胎衣不下患牛血清孕酮偏高，差异极显著（P＜0.01），雌二醇水平低，差异显著（P＜0.05），PGF2ɑ含量亦低，差异极显著（P＜0.01）（表3）。用药后第7天，与空白对照组比较，归芎益母散组奶牛血清中孕酮水平高，差异显著（P＜0.05），PGF2ɑ含量差异不显著（P＞0.05），高、中剂量组雌二醇差异不显著（P＞0.05）；高、中剂量组孕酮极显著低于药物对照组（P＜0.01），高剂量组雌二醇显著高于药物对照组与低剂量组（P＜0.05）（表4）。

表3 用药前各组血清激素含量变化

表4 用药后第7天各组奶牛血清激素含量变化

4 讨论

4．1 归芎益母散对胎衣不下奶牛抗氧化能力的影响

正常情况下，机体的抗氧化能力与不断产生的氧自由基的氧化能力之间保持着动态平衡，不会引起组织损伤。若自由基产生异常增多或机体的抗氧化能力下降，将导致组织的氧化损伤[11]。SOD和GSH-Px是体内清除自由基的主要酶类，这些酶类的活性反映了机体内氧自由基被清除的能力，其氧化产物主要是MDA[12]。

邓惠芳等[13]的研究发现，奶水牛发生胎衣不下或子宫脱垂，其血浆和乳清中TAC水平降低，而MDA含量呈升高趋势。Endler等[14]的研究表明，与胎盘正常自主排出产妇比较，胎衣不下患牛组织中GPX-1蛋白浓度水平降低，GPX1 mRNA表达量也出现下降趋势。GPX是一种硒依赖性抗氧化酶，在细胞抗氧化防御中发挥重要作用。有研究报道，奶牛机体对活性氧抗氧化能力的下调，增加了奶牛患胎衣不下的风险[15]。由此可见，机体对氧化酶抗氧化防御作用的抑制间接或直接影响胎衣不下的发生。

本研究中，胎衣不下奶牛血清GSH-Px和SOD活性较低，而MDA处于较高状态。经归芎益母散治疗后，患牛血清中GSH-Px活性上调，MDA含量下降，说明归芎益母散可通过上调患牛抗氧化酶活性，提高机体抗氧化能力，进而调节机体氧化应激状态。其作用机理可能是，复方中益母草和川芎可提高GSH-Px活性[16,17]，当归中多糖和阿魏酸能够降低MDA水平[18]。

4．2 归芎益母散对胎衣不下奶牛生殖激素的影响

奶牛产犊前后，机体内多种生殖激素协同参与胎衣分离和排出。其中，孕酮是一种维持妊娠的重要激素，可抑制子宫肌的自发性活动，保持子宫安静[19]。而分娩时，血浆孕酮水平降低，则可促进子宫收缩；同时，雌激素水平升高，可促进PGF2α合成，子宫收缩增强。因此，妊娠后期，机体孕酮和雌激素的协同作用，有利于胎儿娩出和胎衣排出[5,6]。

朱永刚等[3]研究发现，胎衣不下患牛血清和胎盘组织中孕酮、PGF2α水平明显降低，而雌二醇水平则升高。Mcnaughton等[15]研究表明，胎衣不下患牛胎盘组织中雌二醇和PGF2α较低，而类固醇激素受体表达增加，导致子宫绒毛膜上皮细胞凋亡率降低，增加了奶牛胎衣不下发生风险。王晓芳等[20]探讨了中药“本草-产安”预防胎衣不下的效果及机制，结果显示，试验组奶牛胎盘组织中孕酮水平显著低于对照组，胎衣不下发病率极显著低于对照组。上述结果表明，产前奶牛机体激素分泌紊乱可能参与了胎衣不下的发生过程。本研究中，胎衣不下患牛血清孕酮水平显著较高，而雌二醇、PGF2α水平则明显较低。

前期研究结果表明，益母草具有改善子宫、卵巢血液循环，调节性激素分泌和代谢的作用[21,22]；当归能显著提高大鼠血清雌二醇的浓度[23]；当归-川芎可降低PGF2α浓度[24]；三棱-莪术组分配伍可降低子宫肌瘤病实验大鼠雌二醇、孕酮含量[25]，说明归芎益母散中单味药或合剂具有调节机体生殖激素的药理作用。本研究表明，经归芎益母散治疗后，胎衣不下奶牛血清孕酮水平明显降低，而雌二醇含量升高，说明归芎益母散可调节胎衣不下患牛血清激素失衡，进而达到病愈的治疗效果。

5 结论

本研究得出，归芎益母散可通过提高患牛机体抗氧化能力以及调节患牛血清中生殖激素而达到治愈胎衣不下的治疗效果。