PTPN22、TNF-α基因多态性与汉族人群自身免疫性血小板减少症的关系研究

万 红 李宝林 杨 平 李婷婷

(西南医科大学附属医院医学检验部，泸州 646000)

自身免疫性血小板减少症是一种临床上常见的获得性器官特异性自身免疫性疾病，其具有血小板减少、皮肤黏膜出血等特征，已有研究证实此类患者多存在免疫功能紊乱[1，2]。自身免疫性血小板减少症的发病率呈逐年上升趋势，随着高通量基因分型技术和现代信息技术的飞速发展，人们对自身免疫性疾病患者基因突变的研究也逐渐深入，自身免疫性血小板减少症的基因突变已成为研究的重点[3]。有研究认为，非受体型蛋白酪氨酸磷酸酶22(non-receptor protein tyrosine phosphatase 22，PTPN22)可编码淋巴酪氨酸磷酸酶，影响T细胞信号，对机体免疫功能发挥调控作用，且该基因多态性与桥本甲状腺炎、Graves病等多种自身免疫性疾病的发生均有密切关系[4]。TNF-α启动子区863位点基因多态性可通过调控TNF-α的表达影响炎症和免疫反应，也被证实与Graves病等多种自身免疫性疾病的发生相关[5]。但目前关于PTPN22、TNF-α基因多态性与汉族人群自身免疫性血小板减少症的关系报道尚少，仍需深入研究。鉴于此，本研究选取汉族人群中100例自身免疫性血小板减少症患者和300例健康志愿者进行对照分析，探讨PTPN22 1 123位点、TNF-α 863位点基因多态性与汉族人群自身免疫性血小板减少症发生风险的关系。

1 资料与方法

1.1资料

1.1.1临床资料 选取2018年1月～2019年5月本院收治的汉族自身免疫性血小板减少症患者100例，配对选取同时间段本院体检中心接收的300例汉族健康志愿者，分别记为疾病组和健康组。疾病组中男性54例、女性46例，年龄24～78岁，平均年龄(55.41±9.15)岁，均为初诊患者，免疫增强剂(卡介苗、胸腺素、免疫核糖核酸等)应用史16例、病毒(肝炎、人免疫缺陷病毒等)感染者共7例、具有遗传史患者10例；健康组中男性160例、女性140例，年龄22～78岁，平均年龄(55.29±9.20)岁，2组性别与平均年龄资料数据经对比差异无统计学意义(P>0.05)。纳入标准：疾病组均符合自身免疫性血小板减少症的诊断标准且均为初诊患者，健康组均为同时间段医院体检中心接收的健康志愿者[6]；排除标准：合并其他类型自身免疫性疾病者，存在先天性免疫功能紊乱者，伴有精神、认知或意识障碍者，理解能力差难以配合完成本研究者，存在药物滥用史、吸毒史、传染病史等，罹患恶性肿瘤者，合并其他系统性疾病者，近6个月存在心脏重大手术史者。本研究经本院伦理委员会批准，所有受检者自愿签署知情同意书。

1.1.2试剂和仪器 DNA提取试剂盒购自美国Promega公司；生物芯片和HOTSTART Taq酶均购自大连宝生物科技有限公司；纯化琼脂、iPLEX反应试剂均购自杭州四季青生物科技有限公司；PTPN22、TNF-α基因PCR反应引物均由美国PE-Cetus公司设计并合成。

Optima MAX-TL型台式离心机购自美国贝克曼库尔特有限公司；HH·S11-4型恒温水浴锅购自常州金坛精达仪器制造有限公司；7900HT Fast型聚合酶链反应(PCR)仪购自美国ABI公司；Mars-550型质谱检测仪购自聚光科技(杭州)股份有限公司；TU-1900型紫外线分光光度计购自北京普析通用仪器有限责任公司；UV-1000型紫外透射仪购自上海嘉鹏科技有限公司。

1.2方法

1.2.1准备工作 真空抗凝管抽取受试者外周血，DNA提取试剂盒提取基因组DNA，需注意严格按照试剂盒说明书操作。将提取的DNA分装，保存于-20℃冰箱备用。2.5%琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA纯度及其完整性。

1.2.2PTPN22 1 123位点基因多态性检测方法 采用聚合酶链反应-基质辅助激光解析电离飞行时间质谱技术检测PTPN22 1 123位点基因多态性，DNA浓度调整为50 ng/μl，DNA纯度260 nm处波长的密度值与280 nm处波长的光密度值的比值为1.7～2.0，PCR反应体系：0.5 μl 10×buffer(预混20 mmol/L氯化镁)+0.4 μl氯化镁+0.1 μl dNTP mix+1.0 μl Primer mix+0.1 μl HOTSTART Taq酶+1.9 μl超纯水+1.0 μl DNA，共5 μl，反应程序：94℃(15 s)，94℃(20 s)，56℃(30 s)，72℃(1 min)，共进行45个循环，然后72℃(3 min)，4℃(终止)。碱性磷酸酶处理方法：在降解扩增反应中使用过量的dNTP，确保后续延伸反应中仅延伸1个碱基，反应程序为：37℃(40 min)，85℃(5 min)，12℃(终止)。将配置好的iPLEX反应液加入上述体系，按照如下程序进行延伸反应：94℃(30 s)，94℃(5 s)，52℃(5 s)，80℃(5 s)，共进行45个循环，然后72℃(3 min)，12℃(终止)。对延伸反应所得产物采用树脂除盐纯化处理，芯片点样，检测结果利用Typer4.0软件进行分析，获得分型结果。

1.2.3TNF-α 863位点基因多态性检测方法 采用多聚酶链反应-限制性片段长度多态性方法检测TNF-α 863位点基因多态性，PCR扩增反应体系为：4 μl DNA模板+3 μl 10×buffer+1.5 μl氯化镁+3 μl 10 mmol/L dNTP+0.5 μl上游引物+0.5 μl下游引物+1 μl 5 U/μl Taq酶，加超纯水至30 μl。扩增反应程序：94℃(2 min)，94℃(20 s)，56℃(20 s)，72℃(40 s)，共进行35个循环，然后72℃(10 min)。限制性内切酶反应体系：3.9 μl 去离子水+1 μl 10×buffer+5 μl PCR扩增反应产物+0.1 μl TaiI限制酶，65℃(4 h)。将所得产物采用3.5%琼脂糖凝胶电泳分离，并于紫外透射仪下观察结果，其中野生型(CC)不能被酶切，纯合变异型(AA)为21 bp和104 bp 2个片段，杂合变异型(AC)为21 bp、104 bp和125 bp 3个片段。

1.2.4观察指标 ①对比2组PTPN22 1 123位点基因多态性；②对比2组TNF-α 863位点基因多态性；③分析PTPN22 1 123位点、TNF-α 863位点等位基因频率与汉族人群自身免疫性血小板减少症的关系，统计比值比(OR)、95%可信区间(95%CI)。

1.3统计学分析 SPSS22.0软件作为统计学分析工具，计数资料以“%”描述，分布资料采用秩和检验，2样本间计数资料采用χ2检验；以Logistic回归分析明确PTPN22 1 123位点、TNF-α 863位点等位基因频率与汉族人群自身免疫性血小板减少症的关系，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1疾病组与健康组PTPN22 1 123位点基因多态性对比 疾病组PTPN22 1 123位点CC、CG、GG基因型分布与健康组相比差异有统计学意义(P<0.05)，且其G等位基因频率明显高于健康组(P<0.05)，见表1、图1～3。

表1 疾病组与健康组PTPN22 1 123位点基因多态性对比[例(%)]Tab.1 Comparison of PTPN22 1 123 gene polymorphism between disease group and healthy group[n(%)]

图1 PTPN22基因启动子区1 123位点序列特异性引物PCR扩增结果Fig.1 Results of PCR amplification with sequence specific primers at 1 123 site in promoter regionNote:M.Marker；3.CC homozygote；7.CG heterozygote；others are GG homozygote.

图2 PTPN22基因检测PCR扩增产物电泳结果Fig.2 Electrophoresis results of PCR products of PTPN22 gene detectionNote:1-6 are GG homozygote.

图3 PTPN22基因启动子区1 123位点3种基因型测序图Fig.3 Sequencing map of three genotypes at 1 123 site of PTPN22 gene promoter

2.2疾病组与健康组TNF-α 863位点基因多态性对比 疾病组TNF-α 863位点CC、CA、AA基因型分布与健康组相比差异有统计学意义(P<0.05)，且其A等位基因频率明显高于健康组(P<0.05)，见表2、图4～6。

表2 疾病组与健康组TNF-α 863位点基因多态性对比[例(%)]Tab.2 Comparison of TNF-α 863 gene polymorphism between disease group and healthy group[n(%)]

图4 TNF-α基因启动子区863位点序列特异性引物PCR扩增结果Fig.4 PCR amplification results of 863 site in promoter region of TNF-α gene

图5 TNF-α基因检测PCR扩增产物电泳结果Fig.5 Electrophoresis results of PCR products of TNF-α gene detectionNote:M.Marker;1-3.CA heterozygotes;4.AA homozygotes;5,6.CC homozygotes.

图6 TNF-α基因启动子区863位点测序图Fig.6 Sequencing map of 863 site in promoter region of TNF-α gene

2.3Logistic回归分析 经Logistic回归分析可知，PTPN22 1 123位点G突变、TNF-α 863位点A突变、免疫增强剂应用史、病毒感染、遗传史均是汉族人群自身免疫性血小板减少症的危险因素(OR=6.903、7.965、5.966、6.994、6.443，P<0.05)，见表3。

表3 Logistic回归分析Tab.3 Logistic regression analysis

3 讨论

自身免疫性血小板减少症主要由血小板产生不足及消耗过多引起，二者均由免疫球蛋白G抗血小板抗体介导[7]。研究认为，自身免疫的主要靶点是血小板糖蛋白，而与自身免疫异常所致的免疫球蛋白G抗血小板抗体水平和功能紊乱有关的因素均可增加自身免疫性血小板减少症的发生风险，进而导致严重危害[8]。基因多态性是近年来临床上关于此类疾病发生机制的研究热点，影响自身免疫系统功能的多种基因的多个位点的基因型分布和等位基因频率均在自身免疫性疾病患者中存在异常[9-11]。研究显示，分析自身免疫性血小板减少症遗传易感性的危险因素和相关基因多态性对控制该病的发生风险和指导此类疾病新药的研发具有重要意义[12]。

本研究显示，疾病组PTPN22 1 123位点CC、CG、GG基因型分布与健康组有显著差异(P<0.05)，且其G等位基因频率明显高于健康组，可知PTPN22 1 123基因多态性在汉族人群自身免疫性血小板减少症患者中存在异常。Logistic回归分析显示，PTPN22 1 123位点G突变是汉族人群自身免疫性血小板减少症的独立危险因素，证实该位点G突变可增加汉族人群患此类疾病的发生风险。PTPN22基因编码产物可对T细胞活化信号的转导产生负调控作用，若1 123位点T基因突变，则其活化程度增强，干扰机体免疫耐受能力，从而诱发自身免疫性疾病，增加自身免疫性血小板减少症的发生风险。既往研究表明，PTPN22 1 123位点基因多态性与自身免疫性血小板减少症的遗传易感性相关；另有研究指出，PTPN22 1 123位点优势等位基因为C，正常人群中C等位基因频率远高于G等位基因频率，而自身免疫性疾病患者中PTPN22 1 123位点G等位基因频率明显高于健康志愿者，与本研究结果相符，共同证实PTPN22 1 123位点G突变可增加自身免疫性血小板减少症的发生风险[13，14]。另有研究指出，自身免疫性血小板减少症患者中PTPN22 1 123位点基因多态性与健康志愿者相近，与本研究结论不符[15]。分析其原因为：本研究所选对象均为汉族人，而上述研究均未明确种族，不同种族人群中PTPN22 1 123位点的基因多态性可能有明显差异；2项研究所选病例性别分布可能存在差异，而性别可能会影响性激素水平进而影响自身免疫功能。

此外，本研究还指出疾病组TNF-α 863位点CC、CA、AA基因型分布与健康组有显著差异(P<0.05)，且其A等位基因频率明显高于健康组，经Logistic回归分析证实TNF-α 863位点A突变是汉族人群自身免疫性血小板减少症的独立危险因素，提示TNF-α 863位点基因多态性与汉族人群患此类疾病的遗传易感性密切相关，且前者A突变可显著增加该病的发生风险。既往关于TNF-α 863位点基因多态性与自身免疫性血小板减少症的相关性报道尚少，但王迎雪等[16]的研究证实TNF-α 863位点A突变可增加免疫性甲状腺疾病的发生风险。另有研究指出，健康志愿者中TNF-α 863位点C为优势等位基因，一旦发生A突变，则可促进局部组织促炎症因子的表达，诱发炎症反应和免疫紊乱[17]。TNF-α的基因多态性多集中于启动子区，863位点A突变可与环境、病毒感染等多种因素共同作用增强自身免疫性疾病的易感性，还可影响患者的病情严重程度。由此可知，TNF-α 863位点A突变可增加汉族人群自身免疫性血小板减少症的发生风险，其作用机制仍需进一步探讨。

本研究Logistic回归分析结果显示，免疫增强剂应用史、病毒感染、遗传史均是汉族人群自身免疫性血小板减少症的危险因素，提示上述因素均可增加汉族人群患此类疾病的风险。结合国内外相关报道分析其中原因为：免疫增强剂应用可促进机体免疫系统活化，若未严格监控可能导致免疫系统紊乱，诱发自身免疫性血小板减少症；人细胞病毒B19、新布尼亚病毒等病毒感染均可引发免疫功能紊乱，并介导免疫相关性出血性疾病，增加自身免疫性血小板减少症发生概率；遗传史是此类疾病的重要危险因素之一，推测与基因多态性异常紧密相关[18-20]。

综上所述，PTPN22 1 123位点、TNF-α 863位点基因多态性与汉族人群自身免疫性血小板减少症的发生密切相关，且PTPN22 1 123位点T突变、TNF-α863位点A突变、免疫增强剂应用史、病毒感染、遗传史等均是汉族人群自身免疫性血小板减少症的危险因素，需加强关注和控制力度。