鸡血藤提取物对大鼠纤维化肝细胞中胶原蛋白表达及TGF-β1/p38MAPK信号通路的影响

韩云雪 李丽梅 石洁琼

(桂林医学院附属医院中西医结合科，桂林 541000)

肝纤维化是指由各种致病因子所致肝内结缔组织异常增生的病理生理过程，是各种数慢性肝病发展为肝硬化不可逾越的阶段[1,2]。因此，遏制肝纤维化的发生对预防肝硬化具有至关重要的意义。鸡血藤，又名血风藤、马鹿藤、紫梗藤，是我国一种传统中药，具有补血行血、通经活络、抗炎、抗氧化、抗病毒、抗肿瘤、免疫调节、镇静催眠等作用[3-6]。近年来，有研究指出，黄芪鸡血藤汤具有预防大鼠肝纤维化的功效，其机制可能与TGF-β1信号通路有关[7]。为研究鸡血藤抗肝纤维化的机制，参照文献[8]构建肝纤维化动物模型，初步探讨TGF-β1/p38MAPK信号通路在鸡血藤提取物预防肝纤维化中的作用，为鸡血藤提取物在肝纤维化疾病中的应用提供了理论依据。

1 材料与方法

1.1材料 8只Wistar雄性大鼠(体质量200～250 g)购于上海凯学生物科技有限公司；M199培养基和胎牛血清购于美国Gibco公司；二甲基亚硝胺(DMN)和Ⅳ型胶原酶购于美国Sigma公司；鸡血藤购于广东南领药业有限公司；无效对照剂Placebo和TGF-β1信号通路激活剂SRI-011381购于美国GLPBIO公司；鼠源Ⅰ型胶原蛋白(Col Ⅰ)抗体、兔源p38MAPK抗体、兔源CyclinD1抗体、兔源P21抗体、兔源GAPDH抗体、HRP标记的羊抗鼠以及羊抗兔Ⅱ抗购于美国Abcam公司；鼠源TGF-β1抗体购于美国Santa Cruz公司。MTT试剂盒购于北京索莱宝生物科技有限公司；RIPA裂解液、BCA蛋白定量试剂盒、Western封闭液、洗涤液、聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride，PVDF)膜购于上海碧云天生物技术有限公司。

1.2方法

1.2.1鸡血藤提取物的制备 鸡血藤提取物制备参照文献[9]进行。取一定量的鸡血藤粉末，加30倍量体积分数为80%的乙醇，回流提取1.5 h，共提取3 次；合并滤液，旋转蒸发浓缩，乙醇回收，用纯化水定容至生药浓度为1 g/ml。给药前用纯水稀释为2、4、8 mg/ml，4℃保存备用。

1.2.2肝纤维化大鼠模型构建 采用二甲基亚硝胺(DMN)按照10 mg/kg腹腔注射大鼠，共3周，每周注射3次。

1.2.3大鼠肝细胞的分离培养、分组和处理 大鼠肝细胞的分离培养参照文献[8]进行。经门静脉灌流Ⅳ型胶原酶消化液分散肝细胞，采用淋巴细胞分离液行密度梯度离心纯化肝细胞，用含10%胎牛血清199培养液重悬细胞，以细胞浓度为5×105个/ml接种培养于培养皿(内置盖玻片)，4 h后更换5%胎牛血清199培养液，贴壁培养48 h后将细胞随机分为对照组(纤维化肝细胞，用5%胎牛血清)、鸡血藤提取物处理组(分别用鸡血藤浓度为2、4、8 mg/ml的细胞培养液处理纤维化肝细胞)、鸡血藤提取物4 mg/ml+Placebo组(用鸡血藤提取物浓度为4 mg/ml的细胞培养液处理纤维化肝细胞后，用Placebo处理)、鸡血藤提取物4 mg/ml+SRI-011381组(用鸡血藤提取物浓度为4 mg/ml的细胞培养液处理纤维化肝细胞后，用10 μmol/L的SRI-011381处理)。另设置正常肝细胞组。

1.2.4MTT实验检测细胞活力 将纤维化肝细胞按照1×104个/孔接种于96孔板，培养24 h后，按照1.2.3实验分组进行细胞处理，分别于培养24 h、48 h、72 h时，各取一组细胞，向每孔内加入20 μl的MTT试剂，孵育4 h后，吸去上清液，再向每孔内加入150 μl DMSO，继续孵育2 h直到结晶充分溶解，全自动酶标仪检测490 nm波长处各孔细胞的吸光度(OD)值。

1.2.5Western blot检测Col Ⅰ、TGF-β1、p38MAPK、CyclinD1和P21蛋白的表达 采用RIPA裂解液提取各组细胞蛋白，BCA蛋白定量试剂盒检测细胞蛋白浓度。取适量细胞蛋白，100℃水溶加热3～5 min使细胞蛋白充分变性，取30 μg变性细胞蛋白进行SDS-PAGE电泳。电泳结束后，将已分离的细胞蛋白转移至PVDF膜。然后，用Western封闭液4℃封闭过夜，吸尽封闭液后，Western洗膜液漂洗膜3次，每次10 min，随后加入已稀释的抗Col Ⅰ、TGF-β1、p38MAPK、CyclinD1、P21和GAPDH的Ⅰ抗(P21为1∶1 000稀释，GAPDH为1∶2 500稀释，其他均为1∶500稀释)，室温条件孵育2 h后，再次用Western洗膜液漂洗膜3次，每次10 min，然后加入相应的Ⅱ抗，室温条件孵育1 h后，于暗处进行ECL显影，拍照后，采用Image J软件对目的条带灰度值进行定量分析(以GAPDH为内参)。

2 结果

2.1纤维化肝细胞和正常肝细胞中TGF-β1/p38MAPK、Col Ⅰ的表达 与正常肝细胞相比，纤维化肝细胞中Col Ⅰ、TGF-β1以及p38MAPK蛋白的表达水平显著升高(P<0.05)。见图1、表1。

表1 TGF-β1/p38MAPK、Col Ⅰ在纤维化肝细胞和正常肝细胞中的表达Tab.1 Expressions of TGF-β1/p38MAPK and Col Ⅰ in fibrotic hepatocytes and normal

图1 TGF-β1/p38MAPK、Col Ⅰ在纤维化肝细胞和正常肝细胞中的表达Fig.1 Expression of TGF-β1/p38MAPK and Col Ⅰ in protein fibrotic hepatocytes and normal hepatocytesNote:1.Hepatocyte；2.Fibrotic hepatocyte.

2.2鸡血藤提取物对纤维化肝细胞增殖的影响 与对照组比较，鸡血藤提取物处理组纤维化肝细胞CyclinD1蛋白的表达显著降低，P21蛋白的表达显著升高，细胞在24 h、48 h、72 h时细胞活力显著降低，并呈显著的浓度依赖性(P<0.05)。表明鸡血藤提取物处理能够抑制纤维化肝细胞的增殖，选用抑制率约为50%的鸡血藤提取物浓度(4 mg/ml)进行后续试验,见图2、表2。

表2 鸡血藤提取物对纤维化肝细胞增殖的影响Tab.2 Effects of extracts from Caulis C on proliferation of fibrotic

图2 鸡血藤提取物纤维化肝细胞增殖蛋白表达的影响Fig.2 Effect of extract from Caulis C on the expression of proliferative protein in fibrotic hepatocytesNote:1.Control;2.Caulis C 2 mg/ml;3.Caulis C 4 mg/ml;4.Calis C 8 mg/ml.

2.3鸡血藤提取物对纤维化肝细胞中TGF-β1/p38MAPK及Col Ⅰ的影响 与对照组比较，鸡血藤提取物4 mg/ml组纤维化肝细胞中TGF-β1、Col Ⅰ以及p38MAPK蛋白的表达水平显著降低(P<0.05)。表明鸡血藤提取物能够抑制纤维化肝细胞Col Ⅰ表达，抑制TGF-β1/p38MAPK信号通路，见图3、表3。

表3 鸡血藤提取物对纤维化肝细胞中TGF-β1/p38MAPK及Col Ⅰ表达的影响Tab.3 Effects of extracts from Caulis C on expression of TGF-β1/p38MAPK and Col Ⅰ in fibrotic

图3 鸡血藤提取物对纤维化肝细胞中TGF-β1/p38MAPK及Col Ⅰ表达的影响Fig.3 Effects of extract from Caulis C on expression of TGF-β1/p38MAPK and Col Ⅰ in fibrotic hepatocytesNote:1.Control；2.Caulis C 4 mg/ml.

2.4TGF-β1/p38MAPK信号通路激活剂SRI-011381能逆转鸡血藤提取物对纤维化肝细胞增殖的影响 图4和表4显示，与对照组比较，鸡血藤提取物4 mg/ml组纤维化肝细胞CyclinD1蛋白的表达显著降低，P21蛋白的表达水平显著升高，细胞增殖活力显著降低；与鸡血藤提取物4 mg/ml+Placebo组相比，鸡血藤提取物4 mg/ml+SRI-011381组纤维化肝细胞CyclinD1蛋白的表达水平显著升高，P21蛋白的表达水平显著降低，细胞增殖活力显著升高(P<0.05)。

表4 SRI-011381可逆转鸡血藤提取物对纤维化肝细胞增殖的抑制作用Tab.4 SRI-011381 can reverse inhibitory effect of extract from Caulis C on proliferation of fibrotic

图4 SRI-011381能逆转鸡血藤提取物对纤维化肝细胞增殖的影响Fig.4 SRI-011381 can reverse effect of extract from Caulis C on proliferation of fibrotic hepatocytesNote: 1.Control;2.Caulis C 4 mg/ml;3.Caulis C 4 mg/ml+Placebo;4.Caulis C 4 mg/ml+SRI-011381.

2.5TGF-β1/p38MAPK信号通路激活剂SRI-011381能逆转鸡血藤提取物对纤维化肝细胞ConⅠ表达的影响 与对照组比较，鸡血藤提取物4 mg/ml组纤维化肝细胞TGF-β1、及Col Ⅰ以及p38MAPK蛋白的表达水平显著降低；与鸡血藤提取物4 mg/ml+Placebo组相比，鸡血藤提取物4 mg/ml+SRI-011381组纤维化肝细胞TGF-β1、Col Ⅰ以及p38MAPK蛋白的表达水平显著升高(P<0.05),见图5、表5。

图5 TGF-β1/p38MAPK信号通路激活剂SRI-011381能逆转鸡血藤提取物对纤维化肝细胞ConⅠ表达的影响Fig.5 TGF-β1/p38MAPK signal pathway activator SRI-011381 can reverse effect of extract from Caulis C on ConⅠ expression in fibrotic hepatocytesNote: 1.Control;2.Caulis C 4 mg/ml;3.Caulis C 4 mg/ml+Placebo;4.Caulis C 4 mg/ml+SRI-011381.

表5 SRI-011381能逆转鸡血藤提取物对纤维化肝细胞TGF-β1/p38MAPK及ConⅠ表达的影响Tab.5 SRI-011381 can reverse effects of extracts from Caulis C on expression of TGF-β 1/p38MAPK and ConⅠ in fibrotic

3 讨论

肝纤维化是肝脏对各种原因所致肝脏损伤的修复愈合反应，以细胞外基质的大量积累为特征，是慢性肝病向肝硬化发展的必经过程。目前，临床尚无安全有效的治疗肝硬化的药物，但近年来中药及其天然产物在抗肝纤维化中的疗效引起研究者的广泛关注。二甲基亚硝胺(DMN)具有肝脏毒性，是一种常用的肝纤维化诱导剂，已被广泛用于构建肝纤维化动物模型[10，11]。本研究采用DMN腹腔注射建立肝纤维化动物模型，观察鸡血藤提取物对纤维化肝细胞生成胶原蛋白和TGF-β1/p38MAPK信号通路的影响，并探讨鸡血藤提取物的保肝作用机制。

肝细胞能合成多种胶原蛋白，主要以Col Ⅰ为主，但在正常情况下，肝细胞的Col Ⅰ合成能力较低或处于抑制状态，而在肝纤维化时Col Ⅰ合成显著增加。当肝纤维化时，TGF-β1通过多种方式激活肝星状细胞(HSC)，促进Col Ⅰ的合成，抑制蛋白酶水解酶的合成及分泌，导致细胞外基质积累增强而降解减少。TGF-β1通过调控TGF-β1/p38MAPK信号传导通路将细胞外刺激传导至HSC，促进HSC活化，进而促进肝纤维化的发生发展[12]。本实验中，DMN腹腔注射后，原代培养大鼠纤维化肝细胞发现Col Ⅰ、TGF-β1以及p38MAPK蛋白的表达显著升高，大鼠肝纤维化模型构建成功。

鸡血藤的保肝作用是近年来的研究热点。李蓉等[13]研究发现，利用黄芪鸡血藤汤灌胃能有效预防实验性大鼠肝纤维化的形成，其机制可能与TGF-β1、CTGF和PDGF-BB表达，抑制肝星状细胞的活化有关；卢识礼等[9]研究发现，鸡血藤醇提物具有较好的降血脂和抗氧化保肝作用；此外，有研究显示鸡血藤总黄酮对肝癌细胞的生长具有抑制作用[14]。本研究发现，鸡血藤提取物处理后，纤维化肝细胞的增殖活力显著降低，CyclinD1蛋白的表达水平显著降低，P21蛋白的表达显著升高，Col Ⅰ、TGF-β1以及p38MAPK蛋白的表达显著减少。表明鸡血藤提取物提取物可显著抑制纤维化肝细胞增殖，抑制Col Ⅰ合成，其机制可能与抑制TGF-β1/p38MAPK通路活化有关。

为进一步验证鸡血藤提取物是通过激活TGF-β1/p38MAPK通路进而发挥抗肝纤维化作用，使用TGF-β1信号通路激活剂SRI-011381激活TGF-β1/p38MAPK通路，发现激活TGF-β1/p38MAPK信号通路能逆转鸡血藤提取物对纤维化肝细胞增殖及Col Ⅰ表达的影响。提示鸡血藤提取物通过抑制TGF-β1/p38MAPK信号通路，抑制Col Ⅰ合成，发挥抗肝纤维化作用，这与曹清等[15]报道TGF-β1/p38MAPK信号通路在大黄酸逆转肝纤维化过程中作用相吻合。此外，魏洁等[16]研究显示，姜黄素对肝纤维化的治疗作用也与负性调控TGF-β1表达有关。

综上所述，鸡血藤提取物通过抑制TGF-β1/p38MAPK信号通路，抑制纤维化肝细胞增殖和Col Ⅰ的合成，进而发挥抗肝纤维化作用。本研究的发现为鸡血藤提取物的开发利用提供了理论依据，鸡血藤提取物有望成为肝纤维化的预防和治疗药物。