塌陷反应调节蛋白家族与肿瘤关系的研究进展

李 俏 曹 渊 蔡慧君 曹三成

塌陷反应调节蛋白(collapsin response mediator proteins，CRMPs)家族，又名TOAD-64/Ulip-2/DRP-2家族，目前包含CRMP1、2、3、4、5共5个成员，他们在物种间高度保守，均为胞质磷酸化蛋白，其中CRMP1、2、3和4显示75%的同源性，CRMP5显示50%同源性[1-2]。该家族最早被发现于中枢神经系统中，能介导神经元突起的生长发育过程，是神经系统损伤和相关疾病的热门潜在治疗靶点[3-5]。近年的研究[6-7]表明，CRMPs家族与肿瘤发展也有密切关系，现做以下综述。

1 CRMP1与肿瘤的侵袭、转移和预后

CRMP1是细胞外导向因子，功能与信号素3A(Sema-3A)类似，可协助细胞轴突的定向延伸和细胞骨架的重组[5]。研究者运用基因微阵列法检测肺腺癌细胞株中的基因表达情况，发现CRMP1表达与肺癌细胞转移呈负相关[6-7]，而免疫组化结果也显示，CRMP1在肺癌中的检出率明显低于邻近的正常组织，且其表达水平与预后密切相关，低表达组患者处于肺癌晚期并有淋巴结转移，高表达组患者无进展生存期和总生存期明显高于低表达组[8]。同时，过表达CRMP1的肺癌细胞形态由梭状条索型变成圆形或者椭圆形，伪足也明显减少，细胞侵袭能力下降。

目前，已在肺癌细胞中发现了2个可以调控CRMP1的上游分子：环氧化酶-2(cytochrome oxidase-2，COX-2)和结缔组织生长因子(connective tissue growth factor，CTGF)。COX-2抑制剂能通过诱导细胞凋亡、抑制细胞周期和周围血管的生成，来达到抑制肿瘤生长的作用[9]。COX-2对CRMP1的调节起着重要作用，可以剂量依赖性地抑制CRMP1 mRNA和蛋白水平的表达，具体机制是通过抑制特异蛋白1(specificity protein 1, Sp1)DNA复合物的形成和增强启动子区域转录因子CCAAT增强子结合蛋白α(CCAAT enhancer binding protein alpha, CEBPA)的活性实现的[10]。CTGF是一种分泌蛋白，整合连接在细胞膜的表面[11]。CTGF在人肺腺癌中表达，与侵袭和转移相关，其在肿瘤组织中表达越低，肿瘤分期越差，淋巴结出现转移越早，复发率越高，患者生存期越短[12]。而CRMP1是CTGF的下游靶点，在肺癌细胞中起着抗侵袭和抗转移的作用，是潜在的抑癌基因。

2011年，Pan等[13]发现了一种新的人类CRMPs家族蛋白，与CRMP1相似但分子量更大，命名为长形塌陷反应调节蛋白-1(long collapsin response mediator proteins 1, LCRMP1)，原有的Y也可称为短型(short collapsin response mediator proteins 1, SCRMP1)。与CRMP1不同，LCRMP1的表达与肺癌细胞的侵袭性呈正相关，转移淋巴节中LCRMP1的表达也远高于原发病灶。同时，LCRMP1表达与患者总体生存率和无进展生存期呈负相关，被认为是一种促癌基因，在非小细胞肺癌中可作为一个新的预后标志物。

髓母细胞瘤是小儿较常见的颅内肿瘤，是中枢神经系统恶性程度最高的肿瘤之一。Li等[14]证实,CRMP1能抑制细胞丝状伪足和应激纤维的形成，从而抑制髓母细胞瘤细胞的增殖、迁移和侵袭。其前期研究[15]表明，高迁移率族蛋白(high mobility group AT-hook，HMGA1)能促进髓母细胞瘤的发育，调控肿瘤细胞的生长、迁移和侵袭过程，在HMGA1敲除的细胞中能够观察到CRMP1表达上调。而进一步的研究[14]表明，HMGA1和CRMP1在髓母细胞瘤中表达呈负相关，HMGA1能够直接靶向结合在CRMP1的启动子上，通过负向调节CRMP1的表达来参与髓母细胞瘤的发生、发展过程。

上皮细胞-间充质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)是肿瘤迁移和侵袭过程中的重要起始步骤，包含上皮细胞骨架及形态向间充质细胞的转变过程[16]，其中Snail是EMT过程中的重要调节因子[17]。Cai等[18]发现,CRMP1在前列腺癌组织等多种癌细胞系中明显下调，是潜在的治疗靶点。CRMP1能促进组蛋白去乙酰化，并直接抑制Snail功能，从而抑制肿瘤细胞EMT，同时参与调解前列腺上皮和前列腺癌中由Snail或转化生长因子-β1(transforming growth factor beta 1, TGF-β1)诱导的EMT抗性。另外，该研究还证实了抑制CRMP1表达能够调控肌动蛋白和WAVE1(一种肌动蛋白成核复合物Arp2/3的激活剂)的结合过程，促进应激纤维的形成，进一步证实了CRMP1很可能作为控制前列腺癌转移的新治疗靶点。

2 CRMP2与肿瘤的预后

对CRMP2的研究主要集中在神经系统发育方面。CRMP2参与神经细胞的微管形成，而该功能受多种磷酸激酶的调节，磷酸化的CRMP2为失活状态。Pooladi等[19]通过二维电泳法将神经胶质瘤及正常脑组织的蛋白提取物进行比对，发现CRMP2蛋白在脑肿瘤组织表达明显上调，是潜在的癌基因，其还发现CRMP2的蛋白pH等电点也与正常脑组织中不同，研究者推测是蛋白磷酸化过程导致了这种差异。其中，Rho蛋白激酶(Rhodopsin)促进CRMP2的磷酸化，可抑制其微管聚集和形成过程，从而抑制细胞的生长和聚集。

CRMP2也同样被发现与肺癌相关，其在正常组织和非小细胞肺癌组织的胞质中均有表达，但是在肺癌组织胞质表达更强，而磷酸化的CRMP2蛋白主要在肿瘤组织的细胞核中表达[20]。该研究还得出,胞质CRMP2蛋白的表达与非小细胞肺癌总生存期和无进展生存期无关，而没有接受辅助治疗的非小细胞肺癌患者中，总生存期较短的患者具有高水平磷酸化CRMP2蛋白的表达。这表明，磷酸化的CRMP2蛋白水平高低与非小细胞肺癌患者的预后相关。

CRMP2在正常组织和结肠癌组织中都有表达，但其在结肠癌中的表达要明显增加，阳性率达58.6%。而在90%以上的癌旁组织中，CRMP2蛋白表达呈阴性或弱阳性，其他家族成员目前未检测到类似现象[21]。该研究还发现，CRMP2蛋白在大肠癌早期组织中的表达要明显高于晚期组织，在有早期淋巴结转移的组织中也较高。在大肠癌患者的血浆中同样发现CRMP2明显升高，可惜的是，研究并没有发现CRMP2蛋白高表达与肿瘤的预后和进展的相关性。这提示，CRMP2或许可作为大肠癌诊断的参考指标，但是其对判断预后的指导价值仍值得商榷[21]。

Shimada等[22]研究发现，在乳腺癌中CRMP2 mRNA和蛋白表达水平均比正常组织中减少，而在CRMPs家族的其他成员并没有发现这一现象，提示非磷酸状态的CRMP2可能并不具有促进癌症侵袭转移的作用。CRMP2的表达与乳腺癌的组织学特征、肿瘤体积大小、淋巴结转移、血管浸润和肿瘤分期并没有直接关系。但磷酸化的CRMP2蛋白只在乳腺癌组织中表达，而正常乳腺组织中不表达，其中细胞周期素依赖蛋白激酶5(cyclin—dependent Kinase 5，Cdk5)和糖原合成酶激酶-3β(glycogen synthase kinase 3 beta，GSK-3β)是该磷酸化过程的重要磷酸激酶，而Cdk5和GSK-3β能抑制乳腺癌细胞的增殖和侵袭能力[23]。提示在乳腺上皮中，CRMP2被Cdk5 和GSK-3β激酶磷酸化而功能丧失，促进了乳腺癌发生和发展。

从以上研究可见，CRMP2在上述几种不同肿瘤组织中的差异性表达(在非小细胞肺癌和大肠癌中高表达，在乳腺癌中低表达)与临床预后无关。但在非小细胞肺癌细胞和乳腺癌细胞中常有磷酸化CRMP2的表达，却与患者的预后息息相关。因此，磷酸化CRMP2被认为是一种潜在的、与临床预后有关的指标。在膀胱癌组织中，CRMP2表达水平与肿瘤分级呈正相关，且CRMP2高表达患者复发率、肿瘤进展率和死亡率明显高于低表达患者，提示CRMP2既是膀胱癌进展过程的促癌因子，又是其预后不良的独立危险因素[24]。

3 CRMP3与肿瘤细胞凋亡

关于CRMP3的研究较少，目前未见其与肿瘤相关的直接证据。研究[25-26]表明，该基因定位在染色体10q25.2-q26区域，该区域在神经胶质瘤中突变率高，并包含多个肿瘤抑制基因，且该家族蛋白间结构保守性与同源性较高，提示了其可能与肿瘤相关。

细胞凋亡程序异常是肿瘤细胞最重要的特征之一[27]。P53是抑瘤基因中的明星分子，能通过调节下游靶基因的转录表达参与细胞周期阻滞、DNA损伤和细胞凋亡过程[28]。Yoshida等[29]首先使用芯片分析技术筛选并通过后续细胞实验证实CRMP3是P53的下游靶基因，在P53表达缺失的细胞系中导入外源性表达的P53，CRMP3基因表达上调，抗癌药物处理也能诱导CRMP3的表达。而P53能与CRMP3的启动子直接结合，激活后者的转录表达使之表达上调，同时参与DNA损伤过程，这提示CRMP3有可能是一个新的细胞凋亡诱导因子及潜在的抑瘤基因。Quach等[30]也发现，CRMP3参与细胞染色质的核心成分——组蛋白H4的去乙酰化过程，阻滞下游转录因子和协同转录因子与DNA结合位点特异性结合，降低转录因子E2F1的抑制程度，从而参与转录因子E2F1依赖的神经元细胞死亡，进一步证实CRMP3具有促进神经细胞凋亡的作用。但是该分子是否在肿瘤的发生、发展过程中扮演重要角色，有待进一步的研究。

4 CRMP4与肿瘤的侵袭、转移和预后

CRMP4与前列腺癌转移过程相关，是提示其预后的潜在指标。Gao等[31]通过对蛋白质表达谱的分析发现，CRMP4基因在良性前列腺增生和前列腺癌中差异性表达，且CRMP4在有盆腔淋巴结转移的前列腺癌中表达明显降低。进一步的随访结果也显示，前列腺癌病灶较为局限，对于CRMP4表达相对较低的患者，更易发生复发和转移。Liu等[32]研究发现，转移性前列腺癌中CRMP4基因启动子区的CpG(胞嘧啶-磷酸-鸟嘧啶)位点甲基化率极高，而局限性前列腺癌及非肿瘤组织CpG位点则未甲基化或仅偶发的甲基化。CRMP4作为一种磷酸化蛋白参与细胞伪足中肌动蛋白的组成，并可以调节细胞骨架的组装，这些特性可能与其抑制肿瘤转移的功能有关。

Hiroshima等[33]报道,在胰腺癌中只发现CRMPs家族中CRMP4的表达，且其水平明显高于正常胰腺组织；他们还发现沉默了CRMP4基因的胰腺癌细胞侵袭能力减弱，但并没有影响其增殖能力；同时CRMP4在低分化腺癌中的表达要高于其他组织类型的肿瘤。研究[33]表明，CRMP4的表达与严重的静脉浸润和肝脏转移有关，而其与淋巴结转移、胰内外神经丛浸润、治愈率或复发率(定义为在平均24.6个月的观察期中，没有再次检测到肿瘤组织的患者或再次检测到肿瘤组织的患者占所有纳入患者的百分数)无关。通过多元回归分析，研究者认为CRMP4是影响胰腺癌总生存期的独立危险因素，CRMP4的表达与淋巴结浸润情况和患者无进展生存期长短有密切关系。

Gaetano等[34]曾发现,在视黄酸诱导分化的神经母细胞中，CRMP4 mRNA表达增加。新近研究[35-36]发现，在维甲酸分化诱导下，神经母细胞瘤CRMP4的蛋白水平升高。CRMP4很难在分化差的神经母细胞瘤组织细胞中检测到，而在神经节母细胞瘤中正在向神经元分化中和星形胶质细胞瘤中完全分化的神经节细胞中呈阳性表达。此外，在神经节母细胞瘤和星形胶质细胞瘤中的向神经元分化的细胞中，CRMP4的表达要高于向其他方向分化的细胞，且并未发现在神经节周围的正常的节细胞中有CRMP4的表达[35]。在神经母细胞瘤中的这些研究发现类似于CRMP4在神经系统发育过程中的表达，这证明了在神经细胞分化过程中存在着CRMP4表达的一过性升高。

CRMP4具有多种剪接异构体，在不同肿瘤中的表达水平和功能均存在差异，在同种肿瘤中也可能有不同。CRMP4在前列腺癌中表达下调，且在发生转移的前列腺癌中表达更低，而在胰腺癌中CRMP4呈高表达[31, 33]。Pan等[13]研究发现，LCRMP1促进非小细胞肺癌的侵袭能力，而SCRMP1在其中起到拮抗作用。其还证明在N-末端第22至72的氨基酸序列片段对丝状伪足的形成十分重要，该片段与CRMP2的核心区域结合可以促进前列腺癌细胞丝状伪足的形成。胰腺癌细胞系Capan -1中发现了一个长度为75 kDa 的CRMP4异构体(CRMP4b)，其与LCRMP1在N-末端的22至72氨基酸序列完全同源。因此，CRMP4b可能参与了胰腺癌的恶性变过程。在神经突触中，分子量75 kDa的CRMP4长异构体(LCRMP4、CRMP4b或TUC-4b)和短异构体(CRMP4a或TUC-4A)也表现出相反的功能特点[37-38]。Guo等[39]发现了类似的情况，CRMP4a 和 CRMP4b 在胃癌中发挥着完全相反的功能。首先，在胃癌组织及肿瘤细胞系中，CRMP4a低表达，CRMP4b高表达。同时，在体内和体外实验中，过表达CRMP4a或沉默CRMP4b均能抑制胃癌细胞的生长，并能观察到细胞出现明显的G1期阻滞和S期缩短。另外，过表达CRMP4a或沉默CRMP4b也能抑制胃癌细胞的迁移、侵袭和黏附。

5 CRMP5与肿瘤侵袭和预后

Yu等[40]在非小细胞肺癌和部分胸腺瘤引起的副肿瘤神经综合症患者血清中第一次检测到了CRMP5的自身免疫抗体，这开启了其在肿瘤研究中的序幕。CRMP5抗体主要在非侵袭性的胸腺瘤患者血清中检出，CRMP5表达阴性的患者拥有更长的生存期，证明CRMP5或许与肿瘤性疾病有关联。肺神经内分泌肿瘤作为一种特殊类型的肺部肿瘤，在临床诊断中经常会被误诊而耽误治疗，所以一旦确诊后必须接受多种方式的综合治疗[41]。通过164个胸部肿瘤标本的队列研究[40]显示，98.6%的低分化神经内分泌肿瘤(包括小细胞肺癌、大细胞神经内分泌癌)中CRMP5蛋白普遍表达并呈强阳性，但在高分化的神经内分泌肿瘤中无表达。CRMP-5在鳞状细胞癌或者腺瘤中无表达，在其他部位来源的肺转移癌中也无表达，提示CRMP5表达具有特异性。CRMP5高表达于恶性程度较高的神经内分泌瘤中，但在低度恶性者中表达甚微，这使其失去了评估预后的价值。而相关病例报道[42-44]显示，患有小细胞肺癌合并视神经副癌综合症及多发动眼神经共济失调患者的血清和脑脊液中的CRMP5抗体均升高，而摘除肺癌组织后，包括副癌综合症的视神经症状明显减轻，提示CRMP5抗体是筛查老年癌症患者伴随视神经损伤的潜在生物标记。

多形性胶质母细胞瘤占恶性星形细胞瘤的80%，预后极差[45]。研究者分析基因表达谱发现，在多形性胶质母细胞瘤中有70个基因高表达。由此将纳入的胶质瘤患者分为两组，发现基因高表达组患者的中位生存期要比整体中位生存期高4倍多。而CRMP5高表达组患者的预期寿命不到低表达组的一半[46];Brot等[47]发现，CRMP5一般表达于正常细胞的胞质中，但是在多形性胶质母细胞瘤中，细胞质、细胞核内均有表达，其还发现这种CRMP5核内的高表达促进了肿瘤细胞的增殖活性。

另有研究[48]表明，CRMP5在骨肉瘤细胞系中高表达，可促进肿瘤细胞的侵袭转移；其在骨肉瘤组织中也呈现高表达，且表达水平与肿瘤患者的生存期呈负相关。同时，抑制CRMP5的表达能明显抑制肿瘤细胞的生长，且小鼠成瘤实验也证实了这个结果，提示CRMP5是一个极具潜力的治疗靶点。

6 结语和展望

CRMPs是成人神经系统中的主要磷酸化蛋白，具有促进轴突生长和神经元分化的生物学功能，其阳性表达与肿瘤细胞的迁移、侵袭和分化密切相关。目前研究显示，CRMPs在多种不同肿瘤中均有表达，且在这些不同类型肿瘤中的功能不同，多与诊断、进展和预后密切相关。目前，关于CRMPs家族与肿瘤的文献报道还较少，而一些研究提示磷酸化的CRMPs表达或许更为重要。在肿瘤的信号分子转导过程中，大部分是通过磷酸化CRMPs路径产生的，可能与其预后有关。另外，虽然CRMPs多表达于胞质中，但也偶见与肿瘤细胞侵袭转移相关的胞核表达，很可能是其发挥抑癌或促癌作用的关键点所在。当然，目前CRMPs家族在肿瘤领域的研究尚处于起步阶段，需要更多的研究来探索其具体机制，尤其是磷酸化的CRMPs蛋白与肿瘤的关系。