高孔隙率海藻酸钠-聚乙烯醇复合海绵的制备及性能1)

马荣秀 张雅伟 戚后娟 石彩 黄占华

(东北林业大学，哈尔滨，150040)

皮肤是人体最大的器官，是维持人体内环境稳态的重要保障，在生活中，皮肤不可避免地会受到创伤，造成体液内水分、蛋白等的流失，细菌很容易在伤口处繁殖引起感染，因此，保护皮肤的健康完整是十分必要的。伤口处理的基本原则是清洁与保护创面，减少组织渗出液，防止细菌感染。为达到以上治疗效果，伤口敷料应运而生[1-3]。理想的伤口敷料应具有如下功能：①避免水分和体液的过分散失；②一定的抗菌性能；③透湿、透气，为创面提供湿润的环境；④生物相容性好及可降解的特点；⑤减少换药次数，减轻环保压力[4-5]。传统敷料如医用绷带和纱布等，都能不同程度地吸收渗出液，对创面愈合有一定保护作用。但是，这类敷料不能为伤口提供湿润环境，被浸透后会失去保护功能，易引起细菌感染[6-7]。海绵类敷料是一种新型的医用敷料，具有连通的微孔结构，透气性能优异，能够吸收大量渗出液，为伤口提供潮湿环境[8]。聚乙烯醇是一种水溶性高分子聚合物，可生物降解，具有良好的生物相容性，在药物缓释及伤口敷料等医学领域有广泛的应用，而单纯的聚乙烯醇吸水性差，限制了聚乙烯醇在医用敷料方面的应用[9-10]。海藻酸钠是一种天然可降解多糖，具有促进伤口愈合、保湿和吸湿等功能[11-12]。本研究以聚乙烯醇和海藻酸钠为原料，利用简单的溶液共混和冻干成型相结合的方法，制备具有高孔隙度的海藻酸钠-聚乙烯醇复合海绵，同时，载入抗菌药物，研制新型兼有创造微湿环境、抑制细菌生长、促进伤口愈合的理想伤口敷料。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

傅里叶红外分光光度计(iS10，美国Nicolet公司)；扫描电子显微镜(QUANTA200，荷兰FEI公司)；X射线衍射仪(D/MAX2200型，日本理学株式会社)；冷冻干燥机(FD-1A-50，北京博医康实验仪器有限公司)；酶标仪(分子设备公司，型号：SpectraMax i3x)。

聚乙烯醇(PVA)，分析纯(醇解度98%～99%，1799型)，上海阿拉丁工业公司；海藻酸钠(SA)，分析纯，上海麦克林生化公司；磷酸二氢钾(KH2PO4)，磷酸氢二钠(Na2HPO4)，分析纯，天津基准化学试剂有限公司；10%中性福尔马林，AR，南昌雨露实验器材有限公司；实验小鼠：健康SPF级昆明小鼠，年龄为8周，雄性，体质量为200 g左右，由辽宁省动物资源中心提供。

1.2 SA-PVA复合海绵的制备

SA-PVA复合海绵的制备流程如图1所示。首先制备质量分数10%的PVA溶液和2%的SA溶液。然后，将两种溶液按比例混合，在40 ℃下搅拌3 h，得到SA-PVA混合液(SA的质量分别为总固体质量的0、10%、20%、40%)。将得到的SA-PVA混合溶液静置2～3 h，以除去气泡。最后，倒入模具中，在-20 ℃下冷冻20 h，室温下解冻4 h，连续3个循环并冷冻干燥制备SA-PVA复合海绵。根据SA的质量分数，将复合海绵分别命名为PS0、PS1、PS2和PS4。通过浸渍的方式载入NFX，得到载药型海绵敷料用于小鼠伤口愈合实验。

1.3 SA-PVA复合海绵的结构表征

样品的红外光谱采用傅里叶红外分光光度计(FT-IR)进行表征，ATR附件，扫描范围为500～4 000 cm-1。样品的形貌采用扫描电子显微镜(SEM)进行表征，在观察之前把样品粘在导电胶上，喷金处理。样品的结晶度采用X-射线衍射仪(XRD)进行测试，扫描范围5°<2θ<50°，扫描速度4°/min。

1.4 SA-PVA复合海绵的性能测试

溶胀性：将干燥的样品制成直径为2 cm的圆柱形，称质量记为M0，浸入37 ℃的去离子水中。每间隔一定时间取出，用滤纸吸去残留水，称质量记为Mt。得到海绵的溶胀率[13]：

(1)

保水性：将干燥的样品制成直径为2 cm的圆柱形，称质量记为W0，浸入37 ℃的去离子水中，待样品完全溶胀后，放入37 ℃环境中。每间隔一定时间，取出称质量记为Wt，采用以下公式计算样品的保水性[13]：

(2)

降解性：将干燥的样品称质量记为M1，浸入磷酸盐缓冲溶液(PBS)中，置于37 ℃恒温振荡器中振荡，速度为200 r/min。第3天、第7天和第14天取出，将样品冷冻干燥，称质量记为M2。由以下公式计算样品的降解性能[14]：

(3)

孔隙率：将样品制成大小相近的圆柱形，称质量，记为m1，测量直径和厚度，计算体积(v)。之后，将样品浸入无水乙醇中(ρ=0.789 3 g/cm3)至饱和，取出后，擦拭样品表面的无水乙醇，称质量，记为m2。孔隙率按以下公式计算[15]：

(4)

1.5 SA-PVA复合海绵的生物相容性

溶血性测试：首先，取新西兰大白兔耳缘静脉血，与柠檬酸钠溶液按照V(大白兔耳缘静脉血)∶V(柠檬酸钠溶液)=9∶1混合，得到新鲜抗凝血。将待测样品浸泡在10 mL 0.9%的生理盐水中1 h后，向试管中加入7 mL生理盐水和0.2 mL稀释抗凝血，V(新鲜抗凝血)∶V(生理盐水)=4∶5，实验组中加入0.1 g海绵，以只加入生理盐水和去离子水的试管分别作为阴性和阳性对照。将试管于37 ℃条件下放置1 h后，于2 500 r/min条件下离心5 min，取上清液，利用酶标仪测量其在545 nm处的吸光度值，计算样品的溶血率[16]：

(5)

式中：ODs、OD(-)和OD(+)分别代表样品、阴性对照和阳性对照组的吸光度值。

细胞毒性测试：利用CCK-8方法测定复合海绵对NIH 3T3细胞生长活性的影响。首先，制备海绵浸提液，将海绵通过紫外照射灭菌4 h，按照0.1 g加1 mL液体的比例向海绵中加入DMEM培养基，在37 ℃条件下放置48 h，取上层浸提液备用。以添加海绵浸提液的组别为实验组，以添加完全培养基的组别为阴性对照组，对NIH 3T3细胞进行培养。于24、48和72 h取出对应的细胞培养板，利用酶标仪测定其在480 nm处的吸光度值。细胞存活率按以下公式计算[17]：

(6)

式中：As和An分别代表阴性对照和样品的吸光度值。

1.6 动物实验

在这项实验中，使用体质量200 g左右的昆明小鼠模拟伤口愈合过程。取若干只小鼠，随机分成3组，分别设为纱布对照组、PS2组和PS2-NFX组。术前将小鼠放置在麻醉罐中通过浸有乙醚的棉花麻醉，进行剃毛及消毒处理，使用手术剪使小鼠背部形成直径约为7 mm的伤口。将相应的样品附着在伤口上，并进行固定。在小鼠术后，定期进行换药处理，并拍照、测量伤口面积，按以下公式计算伤口愈合率[18]：

(7)

式中：S0为手术后小鼠的伤口面积；St为拍照当天的伤口面积。

2 结果与分析

2.1 SA-PVA复合海绵的结构表征

SA、NFX、PS0、PS2和PS2-NFX的红外光谱如图2a所示。可知，SA在1 593、1 408、1 026 cm-1处的吸收峰分别对应CC、C—OH、C—O的伸缩振动[19]。NFX在1 720 cm-1处的吸收峰对应—COOH的伸缩振动，1 610 cm-1的吸收峰对应羟基吡啶酮[20]。PS0的红外光谱在2 927 cm-1处的吸收峰分别对应C—H的伸缩振动；在3 293和1 087 cm-1处的吸收峰分别对应O—H伸缩振动和C—O的伸缩振动[21]。与PS0相比，PS2的特征峰的位置基本无变化，只是羟基峰略微变宽，这可能归因于SA与PVA之间的氢键作用。在PS2-NFX的红外光谱中，可以观察到1 610 cm-1处的特征峰，证明复合海绵已经成功负载诺氟沙星。SA、PS0和PS4的XRD结果如图2b所示。可以看出，SA的特征衍射峰出现在2θ=13.5°，2θ=22.0°[22]，PS0在2θ=19.6°、2θ=22.5°具有两个特征衍射峰[9]。在SA-PVA的XRD图谱中可以观察到衍射峰2θ=19.6°、22.5°，且没有其他衍射峰，表明SA与PVA已完全混合均匀，随着SA质量分数的增加，在2θ=19.6°、22.5°处的衍射峰的强度降低且变得稍宽，这可能是由SA与PVA之间的氢键作用导致的。图3为不同SA质量分数复合海绵的SEM图。可知，复合海绵呈三维多孔结构，PS0、PS1、PS2和PS4的孔径分别为62.45±19.8、66.8±19.7、68.15±21.0和71.9±17.2 μm。随着SA质量分数的增加，复合海绵的孔径增大，这可能是由于SA与PVA之间的氢键作用，使海绵网络的交联密度降低。该复合海绵的孔径利于成纤维细胞的生长和迁移，有助于伤口愈合。

2.2 溶胀性、保湿性、降解性和孔隙率

不同SA质量分数复合海绵的溶胀性能如表1所示，可知，随着复合海绵中SA质量分数的增加，其吸水性能增加，PS0的吸水率为500%，而PS4的吸水率能达到1 400%。一方面，由于SA与PVA之间的氢键作用，破坏了PVA本身的作用力，使海绵的网络结构变得疏松，增加了对水分的吸收；另一方面，SA含有大量的羧基和羟基，提高了海绵的吸水性能。作为医用敷料而言，良好的吸水性可以使敷料迅速吸收渗出液，所制备的复合海绵有良好的溶胀性能，能够短时间内吸收大量液体，在促进高渗出性伤口的愈合方面有一定应用潜能[23]。表2为样品的保水性变化曲线，可知，随着复合海绵中SA质量分数的增加，海绵的保水性增加，原因可能是SA中含有大量的亲水基团，增加了海绵的润湿性和亲水性，容易与水分结合，从而防止水分的蒸发。湿润的环境可以提高伤口处细胞的迁移，从而加速伤口痊愈的过程。

表1 样品的溶胀率

不同SA质量分数复合海绵的降解性能如表3所示，可知，随着SA质量分数的增加，复合海绵的降解率呈递增趋势。第14天，PS0、PS1、PS2和PS4的降解率分别为31.7%、34.5%、37.8%和41.5%。其原因可能是PVA本身存在分子内作用力，SA的加入降低了复合海绵内部的氢键作用力，使得海绵的降解率增加。同时，海绵的降解速度缓慢，能够保证海绵敷料在使用过程中的稳定性。不同SA质量分数复合海绵的孔隙率如表4所示，可知，随着SA质量分数的增加，复合海绵的孔隙率呈递增趋势。PS0、PS1、PS2及PS4的孔隙率分别为82.6%、87.4%、92%和95.1%。高孔隙率的敷料具有疏松多孔的结构，有助于吸收伤口处的渗出液。此外，表面多孔的结构利于营养物质的分散，使细胞更好的附着生长，从而加速伤口的愈合[24]。

表2 样品的保水率

表3 样品的生物降解率

2.3 SA-PVA复合海绵的生物相容性

复合海绵的溶血率结果如表5所示，可知，PS0、PS1、PS2、PS4的溶血率分别为1.49%、1.42%、1.17%和0.63%，溶血指数均低于极限值5%[25]。这可能归因于海绵的制备过程中没有使用任何有毒的化学试剂，PVA和SA都具有良好的亲水性和生物相容性，说明制备的复合海绵属于非溶血性材料，可用作伤口敷料。

表4 样品的孔隙率

表6反应了3个时间点的CCK-8测试结果。可知，不同SA质量分数的复合海绵的细胞存活率均在90%以上。结果表明，该复合海绵无毒性。图4是NIH 3T3细胞在与PS0和PS2的浸提液共培养后细胞的生长情况。24 h时，样品与空白组中均有少量的贴壁细胞，随着时间的延长，细胞开始迅速增殖；48 h时，细胞大量增殖；72 h时，可见大量细胞密集生长，且生长趋势良好。结果表明，该复合海绵具有良好的生物相容性，可用作促进伤口愈合的敷料。

表5 样品的溶血率

表6 NIH 3T3细胞在样品中培养不同时间时的细胞存活率

2.4 动物实验结果

小鼠在手术当天及术后第5天、第15天、第20天的伤口愈合照片及伤口愈合率分别如图5和表7所示。可知，与纱布对照组相比，PS2和PS2-NFX均能对伤口愈合起到促进作用，而经纱布组处理的伤口处的再生皮肤有明显的疤痕。这可能归因于纱布不能为伤口提供潮湿的环境，干燥结痂阻碍了细胞迁移。而海绵敷料在湿润时，与人体皮肤有相近的柔软性，利于细胞的生长迁移，从而加速伤口愈合。而与PS2相比，PS2-NFX组在创伤愈合方面的治疗效果更优。原因可能是湿润的环境下细菌易生长，使伤口感染，而PS2-NFX可以有效地阻止细菌滋生，避免伤口细菌感染，促进伤口愈合[26]。由表7可知，在第20天时，用PS2-NFX组处理的伤口显示84%的愈合率，高于其他两组，原因可能是NFX具有良好的抗菌性，可有效降低伤口感染的机率，加速伤口愈合。综上所述，制备的PS2-NFX伤口敷料可有效促进伤口愈合并减少疤痕形成。

表7 小鼠皮肤经样品治疗后的伤口愈合率

3 结论

本研究成功制备了SA-PVA复合海绵，并对其形态学、吸水性、保水性及降解性等进行了测试。结果显示，所制备的复合海绵呈三维网络结构，且适宜的孔径有利于成纤维细胞的生长，具有促进细胞生长的孔隙率，具有维持创面水分平衡的吸水性和保水性。同时，SA-PVA复合海绵的降解速度缓慢，能够保证海绵敷料在使用过程中的稳定性，从而利于受伤部位的皮肤组织愈合，为其作为伤口敷料创造了条件。SA-PVA复合海绵的生物相容性测试结果显示该敷料是一种无溶血性材料，具有良好的生物相容性。体内伤口愈合实验表明，PS2-NFX可以加速伤口愈合过程。结果显示，制备的伤口敷料在伤口愈合方面具有一定的潜能应用价值。