miR-423-3p在乙型肝炎病毒相关肝癌肝移植组织中表达上调对患者预后的影响

柯瑞盛，陈重发，陈永泰，张思宇，刘昭晖，蔡秋程，江艺，吕立志〔.厦门大学附属第一医院普外科，福建 厦门600；.福建医科大学研究生院，福建 福州50；.厦门大学医学院，福建 厦门600；.中国人民解放军联勤保障部队第九〇〇医院（原南京军区福州总医院）肝胆外科，福建 福州5005〕

原发性肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）患者的5年生存率较差［1］。乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）和丙型肝炎病毒的慢性感染或肝硬化是HCC形成最常见的原因［2］。肝移植（liver transplantation，LT）是HCC和HBV感染的最佳治疗选择，这是LT 的最常见原因［3］。LT 术后HCC的复发是治疗失败的最重要原因［4］，但是，目前还没有用于确定这种癌症复发潜力的标志物［5］。miRNA 是一种长度为20 ～24个碱基的非编码RNA，可参与转录后调控［6］。miRNA调节肿瘤的生物学行为，包括实体癌中的增殖、迁移和侵袭，学者已逐渐关注其在恶性肿瘤复发转移中的作用机制［7］。研究表明，miRNA在肝癌的致癌过程中起着抑癌作用或致癌基因作用［2，8］。既往研究发现，miR-423-3p-Bim轴促进胃癌的进展并激活胃癌的致癌自噬［9］。目前对miR-423在肝细胞肝癌组织中的表达及其与肝移植患者预后的关系尚不十分清楚。本研究旨在结合生物信息学分析方法，并用实时荧光定量聚合酶链反应（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）检测miR-423-3p在HBV-HCC组织中的表达与HBV相关肝癌肝移植患者临床病理特征和预后关系，为肿瘤的早期干预和个性化治疗提供新的防治思路。

1 资料与方法

1.1 使用StarBase V 3.0 数据库预测分析miR-423在肝癌组织中的表达及预后价值：根据Sanger miRBase序列，miR-423 存在两种成熟序列：即miR-423-3p和miR-423-5p［10］。我们使用StarBase V 3.0 在 线 数 据 库［11］（http：//starbase.sysu.edu.cn/index.php），先对miR-423-3p和miR-423-5p在肝癌组织表达进行分析，再进一步分析了miR-423-3p和miR-423-5p表达与HCC患者预后之间的关系。根据starBase v3.0 数据库分析结果，我们下一步再从miR-423-3p和miR-423-5p中选出本研究对象进行后续研究。再进一步分析富集miR-423靶标基因在肿瘤进展中可能参与的KEGG 通路。

1.2 组织来源：一般资料如既往研究所述［12］，从2010年1月— 2015年12 月间在联勤保障部队第九〇〇医院（福州总医院）肝胆外科行肝癌肝移植手术患者中，回顾性收集治疗的106例同种异体原位肝癌肝移植患者（均为HBV感染患者）的肝癌组织和正常癌旁组织（30例，取距离癌组织2 cm 处），以及患者相应临床病理资料，使用qRT-PCR 实验检测肝癌样本中miR-423-3p的表达水平。（肝癌样本均于术中采集添加RNAlater保护液后存于-80℃超低温）。本研究采取双盲法，数据分析医生不清楚肝癌样本中miR-423-3p表达水平，实验室人员不了解患者及临床资料情况。本课题均获得患者及家属的知情同意，并于第九〇〇医院伦理委员会处备案后得以批准实施。入组标准：① 具有HBV感染背景；② 术前未行任何抗肝肿瘤相关治疗。排除标准：①术后3个月内因严重并发症而死亡者；② 因非疾病因素死亡的情况。手术方法：采用原位经典肝移植（无转流）+经下腔静脉逆灌注。供体来源分别为心脏死亡器官捐献供肝（25例，23.5 8%）和尸体供肝（81例，76.4 2%）。术后抗乙肝病毒复发方案和术后免疫抑制方案同本中心既往研究中所述［5，12］。

1.3 随访：随访截止时间为2017年12 月［12］。通过电话咨询和门诊复查随访对患者进行随访。定期检查患者的血常规、肝功能、血清甲胎蛋白值、他克莫司浓度及CT、MRI影像学。详细记录肝移植术后患者的无瘤生存时间、复发时间、复发部位和死亡时间（月），1年内随访未回复的患者被视为失随［5］。

1.4 主要试剂：Trizol 试剂、qRT-PCRSYBR Green试剂盒、逆转录试剂盒购自TaKaRa 公司。寡聚核苷酸引物：目的基因miRNA-423和内参U6均由上海英骏公司设计合成，引物序列如下：PrimiRNA-423-F：5'CTACGGCGACTGTATCTTT 3'；Pri-miRNA-423-R：5'CTGTGGCTTCTCAGAACAA 3'；miR-423-3p Real-time PCR探针序列，为上海吉玛合成，序列如下：AGCUCGGUCUGAGGCCCCUCAG。U6-F：5'TGCACCACCAACTGCTTAGC 3'；U6-R：5'GGCATGGACTGTGGTCATGAG 3'。

1.5 RNA提取和qRT-PCR 检测：常规进行定量qRT-PCR。简而言之，按Trizol 试剂说明书，提取肝组织样品中提取总RNA，应用TaKaRa 逆转录试剂盒合成cDNA。为了测量miR-423-3p，根据制造商的说明，使用了Hairpin-it micro RNA和U6 snRNA 归一化实时PCR定量试剂盒（GenePharma）。基因定量用LC480 实时荧光定量仪检测，以均数±标准差（±s）来表示，实验设置阴性对照用双蒸水代替模板，每个样本3个复孔，重复3次。U6小核RNA用作内部对照，比较Ct（ΔΔCt）方法确定表达倍数变化。对所使用的每种引物进行了熔解曲线分析，并且每种均显示出一个峰，表明了所测试的每种引物的特异性［10］。此外，如前所述，针对U6对miR-423-3p的平均表达水平进行了标准化，最终数据以2-△△Ct进行分析。

1.6 统计学分析：用SPSS21.0 和GraphPad Prism5.0 软件对数据进行统计学分析。通过Student's t-test法分析数据。数据均以均数±标准差（±s）表示。计数资料的组间比较采用χ2检验和Fisher 确切概率法。应用Kaplan-Meier 法计算患者移植术后1、3、5年复发率及存活率。应用Kaplan-Meier方法和Log-rank检验比较miR-423-3p高表达组和miR-423-3p低表达组的存活率差异。P ＜0.0 5表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 生物信息学分析miR-423在肝癌组织中表达及预后价值：采用StarBase V 3.0 数据库分析miR-423-3p和miR-423-5p在肝癌中的表达及预后价值。分析结果表明，miR-423-3p和miR-423-5p均在HCC中高表达（P ＜0.0 5，图1A和1C）。同时，miR-423-3p高表达组HCC患者的预后较差（P ＜0.0 5，图1B），而miR-423-5p表达与HCC患者的预后无关（P ＞0.0 5，图1D）。综上，miR-423-3p作为后续研究对象。

图1 miR-423-3p和miR-423-5p 在肝癌中的表达及与预后相关性

2.2 qRT-PCR实验miR-423-3p在HBV相关肝癌肝移植组织中的表达：qRT-PCR 检测106例肝癌组织及30例正常肝组织中mRNA的表达水平。结果显示，miR-423-3p在HCC组织中明显高于正常肝组织（P ＜0.0 01，图2）。

2.3 miR-423-3p表达与肝移植患者的临床病理学特征关系：本研究进一步探讨miR-423-3p表达与HCC患者临床病理学特征关系，结果表明miR-423-3p表达与无肿瘤包膜、肿瘤直径、Edmonson分级和TNM分期等密切相关（P ＜0.0 01，表1），说明了miR-423-3p可能参与HBV相关肝癌患者的疾病进展。进一步COX多因素回顾分析发现miR-423-3p表达、Edmonson 分级、TNM分期等是患者预后不良的独立预后危险因素（P ＜0.0 5，表2、表3）。

图2 miR-423-3p在肝癌组织和正常肝组织中的表达

2.4 miR-423-3p表达对HBV相关肝癌肝移植患者预后的影响：随访结果同本中心（第九〇〇医院）既往研究所述［12］，至随访截止（2017年12 个月），106例肝癌肝移植患者随访时间为3～96个月，随访中位时间为35个月，5年总累积生存率为为18.8 7%（20例），随访期间共有50 例肿瘤复发（复发率 46.1 7%），复发时间为术后2 ～55个月，复发中位时间为14个月。复发转移前3个主要部位依次为肺26 例（52.0 0%）、肝22 例（44.0 0%）、骨8例（16.0 0%）。

根据qRT-PCR 检测106例肝癌肝移植组织中miR-423-3p表达水平，根据miR-423-3p表达检测的中位表达值（4.9 60）将106例患肝癌肝移植组织标本分成miR-423-3p低表达组（53例）和miR-423-3p高表达组（53例）（图3），结果表明miR-423-3p高表达组的肝癌肝移植患者术后预后不良（P ＜0.0 01）。应用Kaplan-Meier 法生存分析，miR-423-3p高表达组患者1、3、5年累积生存例数分别为41（77.3 6%）、15 （28.3 0%）、3（5.6 6%）；miR-423-3p低表达组患者1、3、5年累积生存例数分别为52（98.1 1%）、38 （71.7 0%）、16（30.1 8%）（表4）。经 Log-rank检验分析显示，miR-423-3p高表达组的肿瘤生存率明显低于miR-423-3p低表达组（χ2＝26.0 38，P ＜0.0 01，图3）。

表1 miR-423-3p的表达与肝癌肝移植临床病理学参数的相关性（例）

表2 肝癌肝移植患者总体生存的单因素分析

3 讨论

肝癌的特征是易于侵犯肝脏的血管系统，导致复发转移［13］。目前肝癌肝移植已占肝移植总数近40 %，肝移植手术不仅可以改善患者术后生存质量，同时移除了整个病肝，可使患者获得治愈肿瘤可能［14］。但是对于肝癌肝移植患者而言，预防肝移植术后肿瘤复发是患者术后能否长期生存的关键问题之一。因此，探索生物学标志物在肝癌肝移植术前能预测复发高危患者并以严格掌握手术指征显得尤为重要［15-16］。但是病毒性肝炎相关肝癌肝移植的诊断和预后标志物在国内外一直存在争论。

表3 肝癌肝移植患者总体生存的多因素Cox回归分析

图3 两组肝癌肝移植患者累积术后生存率的比较

在肝癌中，miRNA的一些成员已被鉴定为是参与该恶性疾病进展过程的功能分子。例如，证据表明，miR-223可以通过靶向肝细胞中的多个炎症和致癌相关基因来改善非酒精性脂肪性肝炎和肝癌发生［17］。如miR-155是一种候选致癌miRNA，在促进HCC细胞侵袭中起重要作用，研究认为miR-155可作为一种预测肝移植术后肝癌复发的新型生物标志物［18］。因此，深入研究miRNA 在肝癌进展中的作用机制，对于改善肝癌肝移植诊断及治疗具有重要意义。miR-423位于染色体17q11的频繁扩增区域［10］。根据Sanger miRBase序列，miR-423存在两种成熟序列：即miR-423-3p和miR-423-5p［10］。miR-423已在多种人类肿瘤疾病中有相关研究。本研究通过用StarBase V 3.0 数据库分析结果表明，miR-423-3p和miR-423-5p均在HCC中高表达。同时，miR-423-3p的高表达与HCC患者的预后较差，而miR-423-5p的高表达与HCC患者的预后无关。故我们下一步选miR-423-3p作为后续研究对象。通过分析富集miR-423-3p靶标基因在肿瘤进展中可能参与的KEGG 通路。发现miR-423-3p靶标基因在肿瘤进展中可能通过参与MAPK 信号通路、胰岛素信号通路等癌症相关的KEGG通路，说明在肿瘤进展中miR-423-3p发挥了一定作用。本研究用qRT-PCR检测106 例肝癌组织及30例正常肝组织中mRNA的表达水平。结果显示在肝癌组织中miR-423-3p表达水平增高。

在胃癌中，miR-423-3p高表达可以通过降低Bim（Bcl2-Interacting Mediator of Cell Death）的表达促进胃癌进程，miR-423-3p-Bim轴可能成为胃癌中潜在的治疗靶标［9］。miR-423-5p可通过抑制ING-4 表达在神经胶质瘤组织中起癌基因的作用，且有助于胶质母细胞瘤的恶性表型和替莫唑胺化学耐药性［19］。在肝癌中的研究表明miR-423-3p通过靶向肿瘤抑制因子p21Cip1/Waf1促进肝癌细胞生长并促进细胞周期G（1）/ S过渡［10］，而miR-423-5p则没有相应功能［10］。miR-423-3p通过调节BRMS1增强肝细胞癌的侵袭性［20］。

本研究进一步探讨miR-423-3p表达与肝移植手术患者临床病理学特征的关系，结果表明miR-423-3p表达与肿瘤包膜、肿瘤直径、分化程度和TNM分期等密切相关，说明了miR-423-3p可能参与乙型肝炎相关肝癌患者的疾病进展。进一步COX 多因素回顾分析发现miR-423-3p表达，分化程度、TNM分期等是患者预后不良的独立预后危险因素。进一步说明了miR-423-3p高表达可能参与了肝癌进展。本研究结果同时也提示miR-423-3p过表达肝癌肝移植患者累积生存率显著低于低表达患者，提示肝癌组织中miR-423-3p高表达与肝移植术后患者预后不良具有相关性，说明miR-423-3p可能在肝癌发生发展及肝移植术后生存均具有一定的作用，可能作为肝癌肝移植患者中诊断和预后的候选生物标志物。

表4 肝癌患者移植术后1、3、5年累积生存率

本研究为单中心回顾性研究，研究结果需要多中心大样本研究证实。但为miR-423-3p 在肝癌肝移植中的后续研究奠定了基础。miR-423-3p 在肝癌复发中的分子调控机制还未明确，值得进一步研究。