胶体金法快速检测蔬菜中多菌灵·吡虫啉和啶虫脒的应用研究

陈美莲　章慧　丰东升　张维谊　韩奕奕　王敏　周雨璊　马颖清　汪弘康　王艺娇

摘要 [目的]研究膠体金法在蔬菜中多菌灵、吡虫啉和啶虫脒残留量检测的应用，并将该方法与液相色谱-串联质谱法比较，证实胶体金试纸条在检测蔬菜中多菌灵、吡虫啉和啶虫脒残留的适用性。[方法]试验验证了胶体金法检测蔬菜中多菌灵、吡虫啉和啶虫脒在不同基质中的灵敏度，并将该方法与液相色谱-串联质谱法比较验证其假阴性和假阳性率。[结果]胶体金法检测蔬菜中多菌灵、吡虫啉和啶虫脒的检出限分别为0.5、0.5和0.2  mg/kg;该方法在不同基质中的稳定性较好;实验室加标验证3种农药残留检测的假阴性率和假阳性率均为0，与参比方法无显著性差异（χ2<3.84）;实物阳性样品验证3种农药残留检测的假阴性率均为0，假阳性率分别为0、0和6.67%，但与参比方法均无显著性差异（χ2<3.84）。除多菌灵与阿苯达唑有100%交叉反应外，多菌灵、吡虫啉和啶虫脒与该研究中试验的常见农药均无交叉反应。[结论]胶体金法快速检测蔬菜中多菌灵、吡虫啉和啶虫脒操作简便、快速、准确、稳定，可作为部分蔬菜上市前残留检测的一种有效手段。

关键词 胶体金法;蔬菜;多菌灵;吡虫啉;啶虫脒;残留量

中图分类号 TS207.5+3文献标识码 A

文章编号 0517-6611（2020）22-0193-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.22.052

Study on Colloidal Gold Rapid Detecting Carbendazol，Imidacloprid and Acetamiprid in Vegetables

CHEN Mei-lian，ZHANG Hui，FENG Dong-sheng et al （Shanghai Agri-products Quality and Safety Center，The Ministry of Agriculture Food Quality Supervision and Inspection Center（Shanghai），Shanghai 201708）

Abstract [Objective]To study the application of colloidal gold method on detecting carbendazol，imidacloprid and acetamiprid in vegetables and compare to liquid chromatography-tandem mass spectrometry method to make sure the reliability of colloidal gold strip for determination of carbendazol，imidacloprid and acetamiprid residues in vegetables.[Method]The experiment verified the sensitivity of colloidal gold method for detecting carbendazim，imidacloprid and acetamiprid in vegetables in different matrices，and compared the method with liquid chromatography-tandem mass spectrometry to verify its false negative and false positive rates.[Result]The detection limit of colloidal gold rapid detecting carbendazol，imidacloprid and acetamiprid were 0.5 mg/kg，0.5 mg/kg and 0.2  mg/kg，their stabilities in different matrix was good.Laboratory labeling verification result showed that the false negative and positive rate were 0，no significant difference with reference method （χ2<3.84）.Physical positive sample verification result showed that their false negative were 0，their positive rate were 0，0 and 6.67%，no significant difference with reference method（χ2<3.84）.There were no cross-reaction between carbendazol，imidacloprid，acetamiprid and other pesticides except for 100% cross-reaction between carbendazol and albendazole.[Conclusion]Colloidal gold rapid detection of carbendazol，imidacloprid and acetamiprid in vegetables are simple，rapid，accurate and stable.It can be used as an effective method to detect the residues of carbendazol，imidacloprid and acetamiprid in vegetables.

Key words Colloidal gold method;Vegetables;Carbendazol;Imidacloprid;Acetamiprid;Residue

基金项目

上海市科技兴农重点攻关项目（2019-02-08-00-15-F01147）。

作者简介 陈美莲（1963—），女，上海人，农业推广研究员，从事农产品质量安全检测及风险评估工作。

收稿日期 2020-04-02;修回日期 2020-05-11

我国是一个农业大国，农药使用品种多、用量大，蔬菜中的农药残留严重影响了我国食用农产品的质量信誉，更损害了消费者的身体健康。目前，专属性强、灵敏度高的农药残留检测方法均为检测费用高、周期长、操作复杂的仪器分析方法。为提高监管与检验效率，降低监管部门、检验部门、种植基地、商家和其他市场流通环节对重点、高风险农药残留项目的监测的成本，解决上述監管需求，急需开发具有特异性强、灵敏度高、样品前处理简单的农药残留快速检测方法。目前国内最常用的蔬菜中农药残留的快速测定方法是酶抑制率法[1]，而该方法受酶特异性影响，检测的农药种类有限[2]，多用于有机磷和氨基甲酸酯类农药的检测[3]。胶体金免疫层析技术是一种将胶体金标记技术、免疫检测技术和层析分析技术等多种方法有机结合在一起的固相标记免疫检测技术，该技术具有简单、快速、准确和无污染等优点，自1971 年Faulk W P和Taylor G M 首次建立，便因其众多优点被广泛应用于医学检测、食品安全及动物疫病诊断等各领

域[4]。在蔬菜农药残留检测中，胶体金免疫层析法可以有效弥补酶抑制率法存在的不足，而且可检测的药物种类更多，但目前生产的检测试纸种类较少，制约了该检测技术的大面积推广[5]。

多菌灵为一种高效低毒的广谱内吸性杀菌剂，生产应用范围广泛，对螨虫有一定的杀灭作用，对果树、粮食作物和蔬菜等的病害和食用菌栽培生产过程中的病害有一定的防治作用，在水果保鲜、防腐防霉等方面也有一定作用[6]。吡虫啉是一种广谱、高效、低毒、内吸性强、残效期长的杀虫剂，对粮食作物、油料、蔬菜、水果等多种虫害有防治效果[7]。啶虫脒是一种新型广谱且具有一定杀螨活性的杀虫剂，广泛用于水稻、蔬菜、果树、茶叶的蚜虫、飞虱等虫害的防治[8-9]。多菌灵、吡虫啉和啶虫脒均为《食品安全国家标准 食品中农药最大残留限量》（GB 2763—2019）[10]在蔬菜产品中有限量规定的农药品种，其中啶虫脒还被列为2018年上海市蔬菜重点推荐使用的农药品种。虽然3种农药均属低毒农药，但其使用广泛，如果过量使用或使用不当，残留在蔬菜中会对人体健康带来隐患，因此其在蔬菜中的残留水平值得关注。为满足蔬菜质量安全的监管和农户生产自检的需要，笔者对胶体金法快速测定蔬菜中多菌灵、吡虫啉和啶虫脒的技术开展了应用研究。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂 多菌灵快速检测试纸条（YRSPN1012）、吡虫啉快速检测试纸条（YRSPN1027）和啶虫脒快速检测试纸条（YRSPN1026），深圳市易瑞生物技术股份有限公司;多菌灵、吡虫啉和啶虫脒标准品，德国Dr.Ehrenstorfer。

1.2 仪器与设备 胶体金法读数仪YR-100，深圳市易瑞生物技术股份有限公司;液相色谱-质谱联用仪（LC-MS），沃特世科技（上海）有限公司。

1.3 检测方法

1.3.1 胶体金法。

1.3.1.1 原理。该研究采用胶体金免疫层析技术，将金标抗体置入检测微孔中冻干，在硝酸纤维素膜的检测线（T 线）

处分别包被多菌灵、吡虫啉或啶虫脒抗原，在对照线（C 线）处包被羊抗鼠IgG 二抗。样本中若含有多菌灵、吡虫啉或啶虫脒，在微孔温育过程中与胶体金标记的多菌灵、吡虫啉或啶虫脒单克隆抗体结合，从而抑制了金标抗体与硝酸纤维素膜上包被的多菌灵、吡虫啉或啶虫脒抗原的结合。若T 线颜色弱于C 线颜色或不显色，即样品中的多菌灵、吡虫啉或啶虫脒含量等于或超过产品检出限，反之则低于产品检出限。

1.3.1.2 前处理。取（2.0±0.1）g剪碎或搅碎后的样品加入到15 mL 或50 mL 离心管中;量取并加入8 mL YRSPN 样品通用提取液，充分振荡混匀，即为待测液。

1.3.1.3 检测。从配套的检测试剂盒里去除红色微孔试剂，依次加入200 μL待测液，用一次性吸管上下抽吸混匀后反应3 min（20～40 ℃）。取出试纸条，将试纸条插入上述红色微孔中，反应6 min（20～40 ℃）。从微孔中取出试纸条，轻轻刮去试纸条下端的吸水海绵，并进行结果判读。若T 线颜色≥C 线颜色，则结果为阴性（未检出）;若T 线颜色

1.3.2 液相色谱-串联质谱检测方法。多菌灵、吡虫啉和啶虫脒的检测按照《水果和蔬菜中450种农药及相关化学品残留量的测定 液相色谱-串联质谱法》（GB/T 20769—2008）[11]规定的方法测定。

1.4 结果评价 试验结果按照国家食品药品监督管理总局制定的《食品快速检测方法评价技术规范》评价胶体金方法的灵敏度、特异性、假阳/阴性率和与参比方法一致性。

2 结果与分析

2.1 不同基质的灵敏度试验 《食品安全国家标准 食品中农药最大残留限量》（GB 2763—2019）[10]中对多菌灵、吡虫啉和啶虫脒在蔬菜中的残留量均有规定。该试验针对该标准中多菌灵、吡虫啉和啶虫脒在各类蔬菜中的限量标准，选定不同蔬菜品种和加标浓度。除GB 2763—2019中明确限量的蔬菜品种外，该试验另选市面上常见的几种蔬菜作为验证样品开展灵敏度试验，每种农药共选定9种蔬菜，具体蔬菜品种详见表1～3。每种蔬菜均设置4个浓度，即本底浓度（空白）、1/2限量值浓度或产品标识检出限浓度（如产品检出限即为该药物在某种蔬菜上的限量值即设定1/2限量值浓度，如产品检出限低于该药物在某种蔬菜上的限量值则设定产品标识检出限浓度）、限量值浓度和2倍限量值浓度。每份试验样品均做3个重复，试验结果见表1～3。胶体金试剂条说明书中描述多菌灵的检出限为0.5～1.0 mg/kg，吡虫啉的检出限为0.5～1.0 mg/kg，啶虫脒的检出限为0.2～0.5 mg/kg。试验结果显示在不同蔬菜基质中多菌灵和吡虫啉的检出限均能达到0.5 mg/kg，啶虫脒的检出限均能达到0.2 mg/kg，3种农药验证的检出限均能达到与胶体金试剂条说明书中描述的最低水平，且能满足国家残留限量标准的要求。

2.2 实验室加标假阳性率试验 多菌灵、吡虫啉和啶虫脒的灵敏度试验中各选取的9种蔬菜均随机在市场上抽取3份，并用液相色谱-串联质谱法确认为阴性，再用胶体金快速试纸条进行检测以验证其假阳性率。液相色谱-串联质谱法中多菌灵、吡虫啉和啶虫脒的检出限分别为0.12、5.50、0.36 μg/kg。结果详见表4，多菌灵、吡虫啉和啶虫脒的假阳性率均为0。

2.3 实验室加标假阴性率试验 多菌灵、吡虫啉和啶虫脒的灵敏度试验中各选取的9种蔬菜均随机在市场上抽取3份，并用液相色谱-串联质谱法确认为阴性，再根据3种农药的检出限浓度进行加标验证，多菌灵、吡虫啉和啶虫脒的加标浓度分别为0.5、0.5、0.2 mg/kg。结果见表5，多菌灵、吡虫啉和啶虫脒的假阴性率均为0。

2.4 实物阳性样品 在试验基地选择生产过程中未使用过农药的绿叶蔬菜，分别对其喷洒主要药效成分为多菌灵、吡虫啉和啶虫脒的农药品种，喷洒后3 d采摘蔬菜运送到实验室，先用仪器方法对样品中农药残留的含量进行测定，再将样品稀释到产品最低检出限的0.5、1.0、2.0倍水平。每种基质做3个平行，每个检出水平做10个平行。验证结果用《食品快速检测方法评价技术规范》评价胶体金方法的灵敏度、特异性、假阳/阴性率和与参比方法一致性，结果如表6所示。实物阳性样品验证多菌灵、吡虫啉和啶虫脒残留的假阴性率均为0，仅啶虫脒在0.1 mg/kg测试浓度有2例假阳性，总体来看3种农药的假阳性率分别为0、0和6.67%，但与参比方法均无显著性差异（χ2<3.84）。

2.5 交叉反应测试 选择哒螨灵、咪鲜胺、嘧霉胺、嘧菌环胺、克百威、毒死蜱、阿苯达唑、甲氰菊酯、溴氰菊酯、百菌清、腐霉利、烯酰吗啉共12种农药开展交叉反应测试。将以上12种农药配制成浓度均为20 μg/mL的混合标准储备液，再将混合标准储备液分别稀释到1.00、0.50、0.20  mg/kg待用。然后分别用100根啶虫脒胶体金试纸条测试1.00、0.50、0.20  mg/kg 的混合標准溶液，结果均为阴性;分别用100根吡虫啉胶体金试纸条测试1.00、0.50、0.20 mg/kg的混合标准溶液，结果均为阴性;分别用100根多菌灵胶体金试纸条测试1.00、0.50、0.20 mg/kg的混合标准溶液，结果除阿苯达唑外均为阴性，而阿苯达唑与多菌灵的交叉反应率为100%。

3 讨论与结论

近年来，我国农产品质量安全管理力度进一步加大，农产品质量安全水平不断提升，但由于我国的蔬菜生产方式仍以家庭小农散户为主，其农药超标的问题还未彻底杜绝，蔬菜质量安全存在隐患。在众多影响因素中，缺乏适于源头生产者的自检手段是关键因素之一。另外，目前我国政府部门的农产品质量安全监管工作中均采用仪器方法进行检测，需要将样品运送到专业实验室才能开展工作，不仅检测成本高、周期长，对操作人员的素质要求还很高，另外还会由于监测经费和检测资源有限而降低抽样比例，而抽样比例越小风险就越大，因此该类检测方法难以完全满足日益严格的农产品质量安全监管需求。我国亟须要适于源头农户自检和现场快速检测的方法[12]。

该研究所报道的蔬菜中多菌灵、吡虫啉和啶虫脒的胶体金快速检测法可在15 min内完成一件样品从前处理到读取结果的全部检测工作，检测结果与液相色谱法串联质谱法相比无显著性差异，该方法更为简便、快速和低成本，且其灵敏度较高，能满足国家标准对多菌灵、吡虫啉和啶虫脒的限量要求。因此可采用该方法开展蔬菜上市前的自检或监测，可有效控制蔬菜中多菌灵、吡虫啉和啶虫脒超标。另外，胶体金快速检测法操作简便，无需专业人员检测，适用于基层人员在田间地头检测，也符合政府管理部门及公众呼吁的农产品质量安全从源头管理的理念，适合推广到基层开展蔬菜中多菌灵、吡虫啉和啶虫脒的快速检测，但使用的过程中要注意排除多菌灵与阿苯达唑的交叉反应。

参考文献

[1] 栾云霞，李杨，平华，等.基于酶抑制法的农药残留快速检测仪器现状及评价[J].食品安全质量检测学报，2012，3（6）：690-694.

[2] 桑园园，柴丽娜，魏朝俊，等.酶抑制法检测4 种辛辣蔬菜农药残留假阳性消除的研究[J].中国农学通报，2009，25（11）：60-64.

[3] 于基成，边辞，赵娜，等.酶抑制法快速检测蔬菜中有机磷农药残留[J].江苏农业科学，2006（5）：170-172.

[4] 冯忠华，李跃龙，陈运勤，等.胶体金免疫层析技术及其在食品安全快速检测中的应用[J].广东饲料，2017，26（12）：39-40.

[5] 刘雅宁，袁宝凤.农药残留胶体金检测方法在蔬菜生产中的应用研究[J].陕西农业科学，2014，60（3）：67-68.

[6]  肖文丹，杨肖娥，李延强.多菌灵在农田土壤中的降解及其影响因子研究[J].环境科学，2012，33（11）：3983-3989.

[7] 谢文，丁慧瑛，蒋晓英，等.液相色谱-串联质谱检测蔬菜和茶叶中吡虫啉的残留量[J].色谱，2006，24（6）：633- 635.

[8] TAILLEBOIS E，ALAMIDDINE Z，BRAZIER C，et al.Molecular features and toxicological properties of four common pesticides，acetamiprid，deltamethrin，chlorpyriphos and fipronil[J].Bioorganic & medicinal chemistry，2015，23（7）：1540-1550.

[9] 庾琴，周华，王静，等.啶虫脒在环境中的降解代谢及其安全性的研究进展[J].农药，2007，46（4）：223-226.

[10] 国家卫和和计划生育委员会，国家食品药品监督管理总局，农业部.食品安全国家标准 食品中农药最大残留限量：GB 2763—2019[S].北京：中国标准出版社，2020.

[11] 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局，中国国家标准化管理委员会.水果和蔬菜中450种农药及相关化学品残留量的测定 液相色谱-串联质谱法：GB/T 20769—2008[S].北京：中国标准出版社，2009.

[12] 李玉花.农产品农药残留快速检测方法[J].云南农业，2016（4）：81-82.