狼疮肾炎小鼠肾组织高迁移率族蛋白B1、Toll样受体、水通道蛋白的表达以及三七注射液的干预机制▲

唐 宇 黄志敏 吴金玉

(广西中医药大学第一附属医院风湿科，南宁市 530023，电子邮箱：521101154@qq.com)

系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus，SLE)是一种累及多器官、多系统并会产生自身抗体的自身免疫疾病，全球总发病率在1.4%～21.9%之间[1]。SLE对系统的损害中肾脏受累最为常见，狼疮肾炎是SLE最严重的并发症，也是患者死亡的主要原因，大约50%的SLE患者并发狼疮肾炎[2]，其中超过25%的狼疮肾炎患者最终将发展至慢性肾衰竭[3]。免疫复合物介导的肾小球肾炎是狼疮肾炎的主要发病机制之一，因此，阻断免疫复合物在肾小球沉积，抑制肾小球肾炎的进展是治疗狼疮肾炎的关键。目前，西医治疗狼疮肾炎以激素、免疫抑制剂为主，必要时行肾脏替代治疗，尚缺乏理想的有效治疗手段。中医药防治狼疮肾炎成为医学领域的研究热点之一。研究表明，高迁移率族蛋白B1(high mobility group box protein 1，HMGB1)/Toll样受体(Toll-like receptor，TLR)信号通路在狼疮肾炎中发挥重要作用；水通道蛋白(aquaporin，AQP)在慢性肾衰竭发生发展中有重要作用[4]。尽管已经明确肾脏组织中存在TLR及AQP的表达，但目前国内外鲜见相关文献报告HMGB1/TLR信号调控AQP相互交叉对话在狼疮肾炎发病机制中的作用。本研究利用理想的狼疮肾炎模型-MRL-Faslpr小鼠，基于“瘀水互生”理论,探讨HMGB1/TLR信号调控AQP对狼疮肾炎发生的影响，并分析三七注射液干预狼疮肾炎的可能机制，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物 11周龄雌性MRL-Faslpr小鼠15只，体重(192±32)g，购自南京大学模型动物研究所，动物合格证号：SCXK(苏)2017-0005。11周龄健康雄性清洁级小鼠5只，体重(200±36)g，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司，动物合格证号：SCXK(湘)2011-0003。 小鼠在广西中医药大学第一附属医院医学分子生物学实验室，室温18℃～25℃、 相对湿度50%～60%、人工12 h昼/夜循环照明环境中饲养，用全价营养饲料、分笼饲养， 每日定时清洗笼舍，小鼠能自由摄食及饮水。

1.2 主要的仪器、试剂和药物 兔抗TLR4抗体(货号：BA1717)，兔抗TLR7抗体(货号：PB0473)，兔抗HMGB1 抗体(货号：A00066-1)，兔抗AQP1抗体(货号：PB0498)，兔抗AQP2抗体(货号：bs-0261R)，兔抗AQP3抗体(货号：BA1559)，兔抗β-肌动蛋白(内参)抗体(货号：bs-0061R)，均购自博士德生物工程有限公司；兔抗TLR9 抗体(Abcam公司，货号：ab52967)，山羊抗兔的二抗(北京博奥森，货号：ZB2301)，RIPA细胞裂解液、苯甲基磺酰氟(北京索莱宝公司，货号：R0020,P0100)，蛋白浓度测定试剂盒(碧云天公司，货号：P0012S)，TRIzol试剂(Invitrogen公司，目录编号：15596-026)，TIANScript RT Kit(天根生物科技有限公司，目录编号： KR104-02)，SuperReal PreMix Plus(SYBR Green)(天根生物科技有限公司，目录编号： FP205)，氯仿、异丙醇、无水乙醇购自天津市永大化学试剂有限公司。荧光定量PCR仪(Applied Biosystems，型号ABI7500)，DYCZ-24DN型电泳仪(北京六一公司)，WSE-400型半干转膜仪(日本ATTO公司)。电泳系统(Mini-protien Tetra System，Bio-Rad公司)，SNJ-1型凝胶成像仪(ChemiDoc XRS+ System，Bio-Rad公司)。

1.3 分组与给药 采用随机数字表法将15只MRL-Faslpr小鼠分为模型组、三七组、 HMGB1抗体组，每组5只。另取5只相同周龄清洁级小鼠为正常对照组。模型组、正常对照组分别予生理盐水10 mL/(kg·d)腹腔注射；三七组给予三七注射液(广西中医药大学第一附属医院制剂室生产，100 mL/瓶，含生药20 g/100 mL)2 g/(kg·d)腹腔注射； HMGB1抗体组给予HMG1/HMGB1单克隆抗体(艾美捷Abnova，货号：MAB8971)1 mg/(kg·d)腹腔注射。均1次/d，4组小鼠在连续给药6周后处死，摘除左肾，放入液氮保存以检测相关指标。

1.4 指标检测

1.4.1 肾组织HMGB1、TLR、AQP蛋白的检测：采用免疫印迹试验检测各组小鼠肾组织HMGB1、TLR4、TLR7、TLR9以及AQP1、AQP2、AQP3蛋白的表达水平。取30 mg肾组织，加入1 000 μL RIPA蛋白裂解液，充分混匀，裂解2～3 h，12 000 r/min离心20 min，将上清转移到新的离心管中。用考马斯亮蓝法蛋白浓度测定试剂盒测定样本蛋白浓度。将样品加入相应4×上样缓冲液,100℃煮沸10 min，12 000 r/min离心1 min，根据目的蛋白分子量大小配制不同浓度的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶，胶凝固后，上样蛋白以恒压80 V，30 min之后恒压120 V，1 h进行电泳。电泳结束后，将凝胶从玻板上取下，装配转膜三明治，以300 mA恒流转60 min，将蛋白转移到聚偏氟乙烯膜上。用封闭液(含5%脱脂奶粉的PBST溶液)室温封闭膜2 h；用新配制的封闭液稀释一抗，兔抗AQP1抗体、兔抗AQP2抗体、兔抗AQP3抗体、TLR4抗体、兔抗TLR7抗体、兔抗TLR9 抗体、兔抗HMGB1抗体、兔抗β-肌动蛋白抗体稀释比分别为1 ∶400、1 ∶500、1 ∶200、1 ∶200、1 ∶400、1 ∶1 000、1 ∶200、1 ∶1 000。4℃，一抗孵育过夜；用TBST洗膜3次，5 min/次；用封闭液稀释各蛋白一抗对应的二抗(兔二抗1 ∶1 000)，室温下孵育二抗1 h。用TBST洗膜3次，5 min/次；在暗室中将膜置于平铺好的保鲜膜上，按1 ∶1比例混合A液和B液(ECL发光液，SC2048)，将混合液均匀滴加于膜上，反应60 s。将膜放在吸水纸上沥干多余的ECL底物反应液，置于平板上，铺上保鲜膜，用保鲜膜包裹聚偏氟乙烯膜(避免产生气泡)，放入暗盒，再放上适当大小的X光片，关闭暗盒，曝光。取出X光片，放入显影液中，待条带显好后取出，在清水中漂洗，放入定影液中定影。取出X光片，晾干、拍照。以β-肌动蛋白作为内参蛋白，计算目的蛋白的相对表达量。

1.4.2 肾组织HMGB1、TLR、AQP mRNA的检测：采用实时荧光PCR检测各组小鼠肾组织HMGB1、TLR4、TLR7、TLR9、AQP1、AQP2、AQP3 mRNA的表达。取30～100 mg肾组织，利用TRIzol试剂提取组织样本中总RNA，严格按照试剂盒步骤进行操作，取1 μL RNA用Denovix超微量紫外可见分光光度计(美国丹诺尔公司)检测RNA浓度和质量，取5 μL RNA 1%琼脂糖凝胶上进行电泳，以检测RNA的完整性。用TIANScript RT Kit 进行反转录，严格按照试剂盒步骤进行操作。获得cDNA后进行实时荧光PCR，以β-肌动蛋白为内参。PCR反应体系为20 μL，包括2×SuperReal PreMix Plus 10 μL、上游引物(10 μM)0.6 μL、下游引物(10 μM)0.6 μL、cDNA 100 ng、50×ROX Reference Dye△ 0.4 μL，加RNase-Free ddH2O至20 μL。PCR反应条件为95℃ 15 min，1个循环，95℃ 10 s、58℃ 30 s、72℃ 30 s，40个循环。整个反应在荧光定量PCR仪上进行，同时在60℃～95℃进行溶解曲线分析。 根据RT-PCR原始检测结果，按照2-ΔΔCt相对定量计算公式，计算出各样品的目的基因相对表达量结果。目的基因和内参基因引物见表1。

表1 基因引物

1.5 统计学分析 采用SPSS 17.0软件进行统计分析。计量资料以(x±s)表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用Tukey HSD检验，方差不齐时采用非参数(Kruskal-Wallis)检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 4组肾组织HMGB1/TLR蛋白及mRNA表达量的比较 与正常对照组比较，模型组及两个给药组HMGB1、TLR4、TLR7、TLR9的蛋白及mRNA相对表达水平均升高(均P<0.05)；与模型组比较，三七组与 HMGB1抗体组的HMGB1、TLR4、TLR7、TLR9的蛋白及mRNA表达量均降低(均P<0.05)。见表2、表3及图1。

表2 4组小鼠肾组织HMGB1及TLR蛋白相对表达量的比较(x±s)

表3 4组小鼠肾组织HMGB1及TLRmRNA相对表达量的比较(x±s)

图1 各组肾组织TLR、HMGB1、AQP蛋白表达

2.2 4组肾组织AQP蛋白及mRNA表达量的比较 与正常对照组比较，模型组及两个给药组的AQP1、AQP2、AQP3的蛋白和mRNA表达量均升高(均P<0.05)；与模型组比较，三七组与 HMGB1抗体组的AQP蛋白、mRNA水平均降低(均P<0.05)。见表4、表5及图1。

表4 4组小鼠肾组织AQP蛋白相对表达量的比较(x±s，n=5)

表5 4组小鼠肾组织AQPmRNA表达量的比较(x±s)

3 讨 论

狼疮肾炎属于中医学“水肿”“阴阳毒”“蝴蝶斑”“关格”“血症”等范畴。“肾虚”“湿阻”和“血瘀”为狼疮肾炎的主要病机[5]，其中以“肾虚”为根本，内生水湿及瘀血加速了病情的进展，瘀血阻滞是其病理改变的关键环节[6]，也是直接损害肾脏组织并促进病情发展的关键因素，水液代谢障碍是疾病最终结局。研究表明，AQP1、AQP2、AQP3与肾脏调节水重吸收功能密切相关，而中医理论的肾脏在水液代谢中的作用与AQP的生理特性极为相似，其中这可能是中医“肾主水”的物质基础[7]。因此，基于“瘀水互生”中医理论基础，我们分析狼疮肾炎小鼠肾组织HMGB1、TLR、AQP的表达，探讨狼疮肾炎的可能病理机制及三七注射液对HMGB1、TLR、AQP表达的影响。

HMGB1是一种参与细胞核内多种生物学功能的核内蛋白，通过与DNA结合以稳定核小体，参加 DNA 转录、复制、基因表达与调控等多种生命活动。HMGB1与TLR结合能诱导树突状细胞的成熟，产生细胞因子和趋化因子，而且成熟的树突状细胞表面共同刺激分子能提供“第二信号”给T淋巴细胞，诱导免疫反应，并通过激活多种信号转导途径而参与SLE所致的肾脏损害[8-11]。其中TLR4、TLR7、TLR9与SLE的疾病进展密切相关，TLR的活化导致前炎性因子表达增加，其可能可以反映狼疮肾炎疾病的严重程度[12-13]。Patole等[14]发现狼疮肾炎小鼠浸润巨噬细胞的肾组织TLR9表达明显增加，TLR9的活化与狼疮肾炎进展相关；Ehlers等[15]研究发现TLR9的活化能促进IgG2a和IgG2b抗体识别宿主产生的DNA，从而进一步加重SLE的发展；而Pacheco等[16]发现，TLR7基因拷贝数变异和TLR7 mRNA水平增加是女性SLE进展的危险因素。TLR7与其配体之间的相互作用可以直接激活树突状细胞和B细胞，从而扩大T细胞和B细胞识别自身特异性抗原效应，进一步加重SLE免疫反应[15]。有研究显示，TLR4过度表达可以导致自身免疫性肾小球肾炎和狼疮肾炎[16-17]。本研究研究结果提示，狼疮肾炎小鼠肾组织中TLR4、TLR7、TLR9、HMGB1蛋白表达水平均升高(P<0.05)，与上述研究结果相似，提示HMGB1/TLR通路与狼疮肾炎的发生密切相关。

AQP是近年来发现的一类与体液代谢关系密切的蛋白，是一族位于细胞膜上的特异性水转运结构，与水通透性(吸收、分泌、转运)密切相关，能维持细胞内外水平衡。现已明确在肾组织中存在8种AQP，即AQP1～4、AQP6～8和AQP11，其中AQP1～3与肾脏调节水重吸收功能密切相关[17-19]。AQP1特异性表达于肾近曲小管和髓袢降支细段[20]，参与水的跨膜转运及水平衡调节，对水的转运具有高度选择性，AQP1缺乏会导致肾小管重吸收功能障碍[21]；AQP2主要分布于集合管主细胞管腔膜及细胞内囊泡，其表达水平及穿梭调节与集合管处水重吸收量的调节密切相关[22]。AQP3在肾间质和肾小球周围的表达疑似沉积的AQP3免疫复合物，AQP3是否 作为自身抗原参与了免疫发病机制，还有待进一步研究[23]。本研究结果显示，狼疮肾炎小鼠AQP1、AQP2、AQP3蛋白表达升高，即狼疮肾炎状态下AQP表达活跃，提示AQP表达上调可能与狼疮肾炎相关。

HMGB1/TLR信号通路是调控各种炎症反应和免疫反应的重要通路，能够参与SLE的肾脏损害，抑制该通路的表达能延缓狼疮肾炎的疾病进展。本研究建立了HMGB1抗体组，给予狼疮肾炎小鼠注射HMG1/HMGB1单克隆抗体，抑制了狼疮肾炎小鼠肾组织HMGB1的表达，结果显示其肾组织TLR4、TLR7、TLR9、AQP1、AQP2、AQP3 的蛋白及mRNA表达也随之下调。因此，我们推测HMGB1/TLR信号调控AQP表达可能是狼疮肾炎小鼠发病的机制之一。

目前，研究表明，三七注射液能下调整合素连接激酶、基质金属蛋白酶-7、转化生长因子-β1、P38丝裂原活化蛋白激酶水平，同时可下调Smad3蛋白、TLR1、TLR2蛋白表达的水平，上调Smad7蛋白的表达水平，抑制肾小管上皮细胞转分化及转化生长因子-β1/P38丝裂原活化蛋白激酶信号通路活化，干预Smad蛋白介导的细胞内信号转导，调节补体-炎症受体系统，实现抗肾纤维化，从而达到缓解慢性肾炎发展到肾衰竭的进程[24-27]，但三七注射液能否通过HMGB1/TLR信号通路降低AQP蛋白表达，达到延缓狼疮肾炎进展的目的目前还尚未清楚。因此，本研究使用三七注射液干预狼疮肾炎小鼠，观察三七注射液对HMGB1/TLR信号通路中的关键蛋白和AQP蛋白表达水平的影响，进一步分析三七注射液在治疗狼疮肾炎中的作用机制。结果显示三七组小鼠肾组织中HMGB1、TLR4、TLR7、TLR9、AQP1、AQP2、AQP3 的蛋白及mRNA表达水平均较模型组降低。因此，我们推测三七注射液可能是通过下调HMGB1/TLR信号通路表达水平，降低AQP蛋白的表达水平，来实现治疗狼疮肾炎和延缓狼疮肾炎疾病进展的目的。

综上所述，狼疮肾炎小鼠肾组织的TLR4、TLR7、TLR9、HMGB1、AQP表达水平均升高，HMGB1/TLR信号调控AQP表达可能是狼疮肾炎的发生机制之一；三七注射液可能通过干预HMGB1/TLR信号调控AQP表达发挥治疗狼疮肾炎的作用。