基于网络药理学的“金叶败毒颗粒”防治COVID-19 作用机制探索

袁发浒，刘 丽，巴瑞琪，陈江源，黄丽霞，朱书秀

（江汉大学 医学院，湖北 武汉 430056）

新型冠状病毒肺炎（coronavirus disease 2019，COVID−19），是一种由严重急性呼吸综合征冠状病毒2（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS−CoV−2）感染导致的急性呼吸道传染病［1］。自2019 年12 月在湖北武汉爆发以来，截至目前，我国已累计报告确诊病例超过8 万例［2］。此次疫情流行严重影响了人民生命安全，在当下缺乏疫苗的情况下，如何保护易感人群值得深入探索。

从中医角度看，新型冠状病毒肺炎属于“疫”病范畴，病因为感受“疫疠”之气［3］。本次疫情暴发以来，我国各地中医药工作者根据疾病情况，提出并运用了许多行之有效的防治方案，国家卫健委发布的新型冠状病毒防控指南中也推荐在医学观察期使用莲花清瘟胶囊、疏风解毒颗粒等中成药［4］。金叶败毒颗粒由金银花、鱼腥草、大青叶、蒲公英组成。方中金银花为君药，鱼腥草为臣药。全方配伍，共奏清热解毒、凉散透达之功［5］。

中药方剂研究长期以来一直采用化学药物的研究方法，将中药化学成分的分离与活性化合物的简单筛选相结合来研究其作用机理。虽然这种方法可以发现一些药效的物质基础和作用机理，但由于中药处方的多组分特点，单一化学成分很难解释中医的整体作用机制［6−7］。网络药理学是近年来生物信息学与药理学相结合而发展起来的一门新兴学科，通过建立一个药用化学成分数据库，研究人员现在可以找到中药有效成分和其作用靶标，以及疾病靶点之间的相互关联，并将这些数据构建为网络关系模型，系统地解释了药物（药方）在疾病治疗中的作用［8］。为对金叶败毒颗粒在COVID−19 防治中的临床应用提供更多依据，本研究拟利用网络药理学方法，探索金叶败毒颗粒的核心化学成分、靶点和作用途径，进而运用分析软件对化合物−靶点进行分子对接以及代谢通路分析等，为后期的深入研究提供参考。

1 方法

1.1 金叶败毒颗粒活性成分筛选

将金叶败毒颗粒中4 种药材的拉丁名分别输入中药系统药理学数据库与分析平台（Tradi⁃tional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP）、中药分子机制的生物信息学分析工具（Bioinformatics Analysis Tool for Molecular Mechanism of Tradi⁃tional Chinese Medicine，BATMAN−TCM）进行药物活性成分查询。口服生物利用度（oral bio⁃availability，OB）是决定口服药物能否克服肠上皮、肠壁等多种障碍到达靶位的重要指标。OB 较差的药物进入血流的效率可能相对较低，因此，治疗效果可能较差。为了区分药物活性成分和非药物活性成分，一般采用量子力学推导的分子物理和分配特性来计算药物类似度（drug−like⁃ness，DL）指数，DL 指数可以用于评估研究药物中化学物质的吸收、分布、代谢和排泄特性。本研究以DL 值（≥ 0.18）和OB 值（≥ 30%）作为筛选药物活性分子的参数，并进一步得到活性化合物对应的靶标蛋白信息。

1.2 COVID-19 相关蛋白靶标筛选

使用关键词“冠状病毒（coronavirus）”“呼吸窘迫综合征（respiratory distress syndrome，RDS）”“严重急性呼吸综合征（severe acute respiratory syndrome，SARS）”从以下3 个数据库中获得可能与 COVID−19 相关的靶标：① UniProt（https：∥www.uniprot.org/）；② 在线孟德尔遗传（Online Mendelian Inheritance in Man，OMIM）（http：∥omim.org/）；③GeneCards（https：∥www.genecards.org/）。

1.3 药物-化合物-靶点网络构建

为了更好地展示金叶败毒颗粒在COVID−19 治疗中的作用机制，通过使用开源软件Cyto⁃scape（版本 3.7.1，https：∥cytoscape.org/download.html）构建了药物−化合物−靶点网络。Cyto⁃scape 是一个开源软件平台，可以图形化地显示、分析和编辑网络。该软件通常使用生物信息学来分析分子和蛋白质之间的相互作用以及蛋白质的生物途径。此外，该软件还包含大量的网络分析插件，可以帮助分析多组件和多目标之间的关系，并可以获取网络的关键节点。因此，它可以帮助识别中医治疗不同疾病的主要机制。

1.4 靶点蛋白间相互作用网络构建

利用 String 在线数据库（https：∥string−db.org/）对靶点基因的蛋白间相互作用（protein pro⁃tein interaction，PPI）进行分析，以相互作用评分（interaction score）设置为最高置信度值（0.900），删除所有自作用蛋白的数据，直观、简洁地显示PPI 网络。利用PPI 关联的Reactome 数据库进行通路分析，Reactome 是一个开放的有关于人体内 pathways、sub−pathways 及 reactions（Pathway steps）等生物过程的精选数据库。Reactome 数据模型的核心单位是反应（reaction）。参与反应的实体（核酸、蛋白质、复合物和小分子）形成生物相互作用的网络，并被分组成通路。Reactome 中的生物途径的实例包括信号传导、先天和获得性免疫功能、转录调节、翻译、凋亡和经典的中间代谢等。

1.5 靶点基因生物信息学分析

在细胞生物学活动中，某些蛋白具有相同或类似的功能，它们之间存在着密切的关系，可以认为它们是一个簇（cluster），同一簇蛋白通常在疾病进展中起着协同作用。通过R 语言包clus⁃terProfiler 进行基因本体（gene ontology，GO）注释和基于京都基因与基因组百科全书（Kyoto En⁃cyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）的通路富集分析。

2 结果

2.1 活性化合物筛选结果

通过 TCMSP 数据库检索后，符合筛选条件OB ≥ 30%、DL ≥ 0.18 的化合物共有31 个，其中金银花含有23 个，鱼腥草含有7 个，大青叶含有10 个，蒲公英含有7 个。进一步与COVID−19相关靶基因关联后，共得到27 个有效化合物，见表1。其中金银花含有16 个，鱼腥草含有5 个，大青叶含有6 个，蒲公英含有4 个。

表1 金叶败毒颗粒中COVID-19 相关活性化合物Tab.1 Active compounds related to COVID-19 in Jinyebaidu Particles

2.2 药理网络

建立金叶败毒颗粒药材有效成分−COVID−19 靶点的药理网络见图1。化合物−靶点药理网络总共包括137 个节点（27 个化合物节点、110 个靶点节点）和235 条关联线。网络中，蓝色箭头标记COVID−19 靶点基因，呈环形分布。根据网络的拓扑学性质筛选等级值（degree）较大的节点进行分析，这些连接化合物或靶点较多的节点在整个网络中起到枢纽的作用，排名前5 位的化合物分别是MOL000098−槲皮素、MOL000006−木樨草、MOL000422−山柰酚、MOL002773−β−胡萝卜素、MOL002309−靛玉红。排名前 5 位的靶点基因是 PTGS2、AR、PRSS1、ESR1、PPARG。

图1 金叶败毒颗粒活性化合物-COVID-19 靶点网络Fig.1 Interaction network between ingredients in Jinyebaidu Particles and COVID-19 related genes

2.3 靶点 PPI 网络分析

在String 在线数据平台上输入110 个COVID−19 靶点，除去独立于网络外的节点后得到如图2 所示的PPI 网络图。PPI 网络中共有110 个节点蛋白，315 条作用连线，PPI 富集度P< 1.0E−16。生物相互作用通路数据库（Reactome Pathways）分析表明该PPI 主要富集了白介素信号通路（HSA−449147 signaling by interleukins）、免疫系统中的细胞因子信号通路（HSA−1280215 cyto⁃kine signaling in immune system）、信号传导通路（HSA−162582 signal transduction）、酪氨酸激酶受体信号通路（HSA−9006934 signaling by receptor tyrosine kinase）、RUNX2 介导的转录调节通路（HSA−8878166 Transcriptional regulation by RUNX2）等。

2.4 GO 注释

对金叶败毒颗粒活性化合物−COVID−19 靶点进行GO 注释，富集分析得到GO 条目2 138 项（P< 0.05），其中生物过程（biological process）1 947 项、细胞组成（cellular component）54 项、分子功能（molecular function）137 项。各列出3 类GO 条目前20 条注释（见表2）。生物学过程中主要包含营养水平应答（GO：0031667）、脂多糖应答（GO：0032496）、细胞对外界刺激应答（GO：0071496）、细菌源性分子应答（GO：0002237）、活性氧簇反应（GO：0000302）等。细胞组成中主要富集条目为膜脂筏（GO：0045121）、膜微结构域（GO：0098857）、膜区（GO：0098589）、膜小窝（GO：0005901）、囊腔（GO：0031983）等。分子功能富集条目中主要包含细胞因子受体结合（GO：0005126）、磷酸酶绑定（GO：0019902）、受体配体活性（GO：0048018）、细胞因子活性（GO：0005125）、激素受体结合（GO：0051427）等。

图2 金叶败毒颗粒活性化合物-COVID-19 靶点PPIFig.2 Protein-protein interaction network between ingredients in Jinyebaidu Particles and COVID-19 related genes

表2 金叶败毒颗粒活性化合物-COVID-19 靶点的GO 注释Tab.2 GO terms of ingredients in Jinyebaidu Particles related to COVID-19

续表2

续表2

2.5 KEGG 通路分析

通过R 语言包clusterProfiler 对110 个靶蛋白进行KEGG 富集分析，富集分析得到KEGG 信号通路134 条（P< 0.05），根据富集评分列出前20 项通路并进行图形化展示，得到KEGG 通路柱状图见图3。主要富集的通路有晚期糖基化终产物配体−受体（AGE−RAGE）信号通路、流体剪切力与动脉粥样硬化通路、膀胱癌、肿瘤坏死因子信号通路、前列腺癌、卡波西肉瘤相关疱疹病毒感染、内分泌抵抗、胰腺癌、甲型流感、白介素17 信号通路、人巨细胞病毒感染、癌症中的蛋白聚糖、美洲锥虫病、结直肠癌、松弛素信号通路、丙型肝炎病毒、麻疹、乙型肝炎病毒、C 型凝集素受体信号通路、人类亲T 细胞病毒1 感染等。

图3 金叶败毒颗粒活性化合物-COVID-19 靶点的KEGG 通路富集Fig.3 KEGG terms of ingredients in Jinyebaidu Particles related to COVID-19

3 讨论

自COVID−19 疫情发生以来，中医药起到了积极的防治作用。本研究应用网络药理学方法，通过整合靶标预测、药理网络构建和生物信息学模块分析预测了金叶败毒颗粒对COVID−19的潜在作用机制。金叶败毒颗粒中的槲皮素、木樨草素、山柰酚可能是对COVID−19 起主要作用的成分，其药理机制主要涉及到白介素信号通路、TNF 信号通路等炎性相关途径，抗氧化应激通路以及病毒感染相关途径。

目前认为，肺部的炎性细胞因子风暴可能是导致COVID−19 病情快速进展的主要原因［9−10，4］，金叶败毒颗粒中的相关活性分子可能在相关机制中发挥作用。Wang 等［11］发现，槲皮素可抑制细胞凋亡并减少炎症细胞因子白介素6（interleukin−6，IL−6）和肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor−α，TNF−α）的产生，减轻脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）引起的 WI−38 肺成纤维细胞的炎症损伤。Al−Rasheed 等［12］通过注射亚硝酸钠建立大鼠肺缺氧损伤模型，发现槲皮素和/或褪黑激素可通过下调免疫炎症介质和热休克蛋白表达来保护缺氧肺组织。和槲皮素类似，Liu等［13］发现，木犀草素以剂量依赖的方式通过下调miR−132 减轻LPS 诱导的核因子−κB（nuclear factor−κB，NF−κB）信号通路的激活，减轻了LPS 诱导的 BEAS−2B 细胞（人肺上皮细胞）活力丧失、炎性细胞因子表达及凋亡。在一项对62 例新型冠状病毒肺炎患者的实验室指标分析研究中发现，危重型患者血小板指标显著降低［14］。靛玉红可通过激活细胞血小板生成素受体，促使TNF 表达正常化来抑制原发性免疫性血小板减少症的炎症，从而在血小板生成中起直接作用［15］。

急性呼吸窘迫往往导致肺组织处于低氧环境，诱导活性氧的增加，造成肺组织氧化损伤并进一步加剧炎性损伤［16］。低氧诱导转录因子家族（hypoxia−inducible transcription factors，HIFs）对维持组织内的氧稳态至关重要，HIFs 由一个持续表达的HIF−1β 亚基以及受组织内氧水平严格调控的 HIF−α 亚基（HIF−1α 和 HIF−2α）组成。肺组织缺氧时，HIF−1α 诱发大量的促炎细胞因子表达［17］，如肿瘤坏死因子 α（tumor necrosis factor−α，TNF−α）和白介素 1β（interleukin−1β，IL−1β），并通过氧敏感的核因子−κB（nuclear factor−κB，NF−κB）进一步加剧炎症反应［18］。本研究 KEGG 通路分析发现，HIF−1 信号通路（hsa04066 HIF−1 signaling pathway，P= 5.69E−12）在金叶败毒颗粒治疗COVID−19 中可能发挥了关键作用。

综上所述，本研究采用网络药理学方法对金叶败毒颗粒治疗COVID−19 的作用机制做了初步预测，分析了该方发挥药效的主要药效物质，初步探索了金叶败毒颗粒抗COVID−19 的生物学机制，为后续临床用药提供了一定的参考，但仍需临床试验进一步验证其确切疗效。