长链非编码RNA在风湿免疫病发病分子机制中的研究进展

蒲金呈， 王 璇 综述， 汤建平 审校

(同济大学附属同济医院风湿免疫科，上海 200065)

长链非编码RNA(long non-coding RNA, lncRNA)是一类长度大于200个核苷酸且不具备蛋白编码功能的RNA，起初被认为不具有任何功能，但随着研究的进一步深入，lncRNA在生物学和人体发病过程中发挥的调控作用被发现。其中，lncRNA参与免疫系统多个环节的功能调节，在风湿性疾病发病过程中有十分重要的作用。近年来一些研究提示lncRNA通过多种途径参与调节多种风湿免疫病发病相关基因的表达，从而影响该病的发病过程。

1 lncRNA

lncRNA在真核细胞中普遍表达，长度大于200个核苷酸，且不具有蛋白质编码功能，大部分通过RNA聚合酶Ⅱ转录产生[1]，和mRNA结构相似，具有5′帽子和3′polyA尾，也存在转录后选择性剪接，但其序列常缺乏翻译蛋白所需的开放阅读框(open reading frame, ORF)，在表达上则具有明显的组织特异性和时空特异性，多数表现为精细的亚细胞定位[2]。

人类98%基因组转录的RNA后不能进一步翻译，这些RNA只能以非编码的形式存在[3]。而根据lncRNA在基因组上与蛋白编码基因的位置关系，可将其分为5类，分别是双向lncRNA、正义lncRNA、反义lncRNA、内含子间lncRNA及基因间lncRNA(intergenic lncRNA, lincRNA)[4]。LncRNA通过染色质修饰和直接的转录调控参与基因调控的基本过程，根据其参与基因调控的作用方式，将其分为顺式和反式lncRNA[5-6]。LncRNA产生主要有6种方式: (1) 蛋白质编码基因序列结构中断；(2) 染 色质重排使两段不转录的基因合并；(3) 在非编码基因复制过程中出现反移位；(4) 局部的复制子串联；(5) 蛋白编码基因片段中有转座子插入；(6) ORF出现突变等[7]。

在基因组转录过程中，lncRNA最初被认为是意外产生的不具备任何生物学功能的一类RNA[8]。但随着研究的进一步深入，发现lncRNA可以通过多种方式(如RNA-DNA相互作用、RNA-RNA碱基配对、RNA-蛋白相互作用等)在多种层面参与调控基因表达，从而参与X染色体沉默、染色质表观修饰、转录激活、转录干扰、核内运输等重要过程[2]。

目前关于lncRNA的研究主要通过lncRNA-seq或基因芯片检测不同细胞或者组织中lncRNA的表达水平，发现差异表达明显的lncRNA[2]。再通过RT-PCR或者RT-qPCR验证,进一步通过QD-FISH(fluorescence in situ hybridization)原位杂交技术进行定位，或qRT-PCR分析由细胞核质分离试剂盒分离得到的RNA来检测其分布。通过5′cDNA末端快速扩增(rapid amplification of cDNA ends, RACE)获取lncRNA5′全长，3′RACE获取lncRNA3′全长，最终得到lncRNA完整的全长序列。通过过表达或沉默lncRNA后观察表型，来研究lncRNA对细胞增殖、分化、凋亡和功能等的影响。通过构建lncRNA过表达质粒或慢病毒、腺病毒包装载体实现lncRNA过表达，通过siRNA、shRNA、反义核酸、CRISPR/Cas9等实现lncRNA沉默，经qRT-PCR等验证上下调后观察疾病相关基因表达和细胞表型等改变。还可以通过利用体外转录、RNA pull down、RNA结合蛋白免疫沉淀(RNA binding protein immunopre-cipitation, RIP)、RNA纯化染色质分离(chromatin isolation by RNA purification, CHIRP)-seq等研究lncRNA与DNA、RNA和蛋白质的相互作用[2]。

目前lncRNA已在干细胞、个体发育和神经科学等诸多生物学研究领域中发挥着越来越重要的作用。而随着高通量RNA测序技术的发展及相关研究的开展，更多lncRNA的功能及作用途径得以阐释，但仍有许多lncRNA的功能及相关的分子生物学作用机制不甚明了，有待进一步探索，包括许多与免疫系统有关的lncRNA。目前对编码基因附近的lincRNA研究最为深入，它可以通过正向或负向调控基因转录进而产生不同的生物学效应[9]。越来越多的研究证实lncRNA参与免疫紊乱甚至多种自身免疫疾病的发生。

2 lncRNA与免疫系统

2.1 lncRNA与骨髓造血干细胞

机体的免疫应答包括固有免疫应答和适应性免疫应答，人体的多种细胞参与其中，其中大部分细胞由造血干细胞(hematopoietic stem cells, HSCs)增殖分化而来。现有研究表明lncRNA在HSCs和免疫反应相关细胞的增殖分化过程中起着很大的作用。

作为最有名的lncRNA分子，X染色体失活特异转录物(X-inactive specific transcript, XIST)，它的缺陷会引起HSCs异常分化[10]；另一lncRNA H19的敲除则会使HSCs静止期缩短[11]。通过高通量测序，Luo等[12]在鼠的HSCs中发现了159个表达上调的lncRNA，其中lncHSC-1和lncHSC-2特异性表达于HSCs，lncHSC-1在HSCs分化过程中发挥重要作用，而lncHSC-2参与了骨髓细胞分化及T细胞分化，lncHSC可能通过与造血细胞特异性转录因子E2A相互作用参与功能调控，具体机制仍待进一步研究[12]。

在免疫应答的过程中，基因转录及转录后水平的调控与免疫反应相关细胞的分化及活化密切相关，而lncRNA参与了这一调控过程，提示lncRNA可能通过调控免疫细胞的分化与活化过程，进而影响免疫应答过程[13]。

2.2 lncRNA与免疫细胞

2.2.1 lncRNA与固有免疫细胞 作为抵抗外界物质入侵的第一道防线，固有免疫参与启动和维持机体的免疫应答。在固有免疫应答过程中，巨噬细胞、自然杀伤(natural killer, NK)细胞、树突状细胞(dendritic cells, DCs)等发挥了重要的作用。病原体入侵后，固有免疫细胞中一些lncRNA会出现明显的上调或下调，据此考虑lncRNA可能通过影响固有免疫细胞参与固有免疫应答的调节[14]。

一项研究对Toll样受体(Toll-like receptors, TLRs)激动剂刺激的巨噬细胞进行全基因组表达分析，进一步研究发现其中的一个由TLRs刺激诱导产生的lncRNA ROCKI(regulator of cytokines and inflammation)，它能通过多种途径发挥促炎作用，此外还发现影响其表达的基因突变能降低结核和克罗恩病等炎症感染性疾病风险[15]。另有研究报道，肿瘤坏死因子-α和异质核糖核蛋白L相关的免疫调节lincRNA(TNF-α and hnRNPL related immuno-regulatory lincRNA, THRIL)通过与异质核糖核蛋白L(heterogenous nuclear ribonucleoprotein L, hnRNPL)形成复合体结合肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor, TNF)-α启动子区下调其表达来参与人类固有免疫反应，进而导致炎性疾病[16]。Hu等[17]发现在巨噬细胞后期炎症基因转录过程中，lincRNA-Cox2通过激活NF-κB起调控作用。

作为重要的抗原提呈细胞，树突状细胞同时参与了固有免疫应答和适应性免疫应答，是免疫应答过程中关键的一部分。一项研究通过测序技术从DCs中筛选出一种特异性表达的lncRNA，并命名为lnc-DC，通过RNA-pulldown、ChIP-seq等技术发现lnc-DC能通过与STAT3结合抑制其去磷酸化，促进人和小鼠树突状细胞成熟。发现下调lnc-DC可以降低与DCs抗原提呈相关基因表达，影响DCs的抗原提呈功能，进而影响T细胞功能和相关细胞因子的分泌[18]，影响适应性免疫应答过程。

2.2.2 lncRNA与适应性免疫细胞 适应性免疫应答是免疫应答过程中重要的组成部分，主要是T细胞和B细胞活化、增殖、分化并产生一系列生物学效应的过程。

CD4+T细胞主要分化成Th1、Th2、Th17和Treg等效应细胞参与适应性免疫应答。其中Th1和Th2细胞lncRNA相关的研究最多。目前已有一些特异性表达于Th1和Th2细胞中的lncRNA被发现[19]。在T细胞中最早发现的lncRNA是活化T细胞核因子的非编码抑制子(noncoding repressor of nuclear factor of activated T cells, NRON)和T细胞非编码转录本(non-coding transcript in T cells, NTT)[19-20]。NRON可能与白细胞介素2(interleukin 2, IL-2)表达的调控有关[20]，而NTT则可能与γ-干扰素(interferon γ, IFN-γ)受体基因表达调控有关[19]。TMEVPG1(或NeST)[21-22]是一种在Th1细胞中特异性表达的lncRNA，通过上调IFN-γ编码基因的表达影响免疫应答。在Th2细胞中特异性表达的lincRNA-Ccr2-5′AS则与参与Th2细胞趋化因子信号通路的基因高度相关[22]。有研究证实敲除lincRNA-Ccr2-5′AS能降低其邻近趋化因子受体基因的表达，并影响Th2细胞向肺组织的迁移。同时它还能协同GATA3调控Th2细胞中免疫基因表达，继而影响Th2细胞增殖。

一项研究提出lncRNA可能通过与B细胞分化相关的特异性转录因子PAX5结合影响B细胞的分化，进而影响适应性免疫应答[23]。

3 lncRNA与风湿免疫病发病机制

3.1 lncRNA与干燥综合征(Sjogren’s syndrome, SS)

SS是一种自身免疫性疾病，主要是淋巴细胞浸润影响唾液腺、泪腺等全身外分泌腺功能，并可累及全身多部位脏器[24]，其发病机制仍不甚清楚，根据现有的研究，SS的发病可能与免疫耐受缺陷，T、B淋巴细胞功能异常，细胞因子异常等有一定的相关性[25]。

对于SS相关的lncRNA，已有一些学者作出一些总结。其中，Sandhya等[26]根据既有文献和微阵列芯片数据，提出可能与SS发病相关的lncRNA，包括NeST、lincRNA-Cox2、lncRNA-CMPK2、MALAT1、lincRNA-Ccr2-5′AS等。Gao等[27]提出有11种lncRNA与SS相关联，包括ENST00000420219、ENST00000455309、ENST00000546086、LINC00426、LINC02384、Lnc-UTS2D-1: 1、n336161、n340599、NR_002712、TCONS_l2_00014794、TMEVPG1。

Shi等[28]通过微阵列分析SS患者及正常人的唇腺活检标本，对比发现SS患者与正常对照组的唇腺组织有显著差异表达的1243个lncRNA，其中890个较对照组上调，353个较对照组下调，通过RT-PCR技术对其中显著差异表达的8个lncRNA进行验证，证实差异性表达存在，且与病程、β2-微球蛋白、血沉(erythrocyte sedimentation rate, ESR)、类风湿因子(rheumatoid factor, RF)、免疫球蛋白(immunoglo-bulin, Ig)A和IgM等密切相关，其中ENST0000-0455309.1最为显著。进一步通过lnc-RNA-mRNA共表达网络对这8个lncRNA进行分析，发现它们可能通过NF-κB、趋化因子及TNF信号通路实现对基因表达的调控[28]。

Kambara等[29]研究发现，SS患者外周血单核细胞(peripheral blood mononuclear cell, PBMC)中过表达干扰素(interferon, IFN)应答基因，通过IFN-α处理可以使人肝细胞中lncRNA-CMPK2表达出现明显上调。Wang等[30]于2016年的研究显示，SS患者Th1 细胞比例、IFN-γ、T-bet及CD4+T细胞内的TMEVPG1较正常人明显升高，其中TMEVPG1表达与ESR、IgG、人干燥综合征A抗原(Sjogren’s syndrome-related antigen A, SSA)正相关，提示TMEVPG1可能通过调控T-bet影响IFN-γ的表达而影响SS发病过程，也揭示了TMEVPG1用于SS患者疾病风险评估以延缓其进展及通过对应的siRNA下调TMEVPG1治疗SS的可能。IFNG-AS和心肌梗死相关转录物(MIAT，也称为RNCR2)在SS患者中上调[26,30]。SS患者CD4+T细胞中的TBX21(encoding T-bet)和IFNG mRNA的水平相较于健康个体上调[30]，表明IFNG-AS1在SS发展中的作用。

最近一项对150例中国汉族原发性干燥综合征患者的研究提示，H19 rs2839698、rs3741219和HOTAIR rs920778多态性可能与中国人原发性干燥综合征的遗传背景无关[31]。

本研究小组通过艾拉莫德对SS模型小鼠进行干预，发现鼠颌下腺中lncRNA-Gm26670的表达显著下降，通过生物信息学预测，发现Gm26670可能作用于其下游同样位于1号染色体的肿瘤坏死因子受体相关分子5(tumor necrosis factor receptor-asso-ciated factor 5, TRAF5)的mRNA(NC_000067.6，191997203.192092599)序列。后续表达验证发现，TRAF5经艾拉莫德干预后，在小鼠颌下腺组织表达显著上调。

3.2 lncRNA与类风湿性关节炎

类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis, RA)，一种以滑膜炎为主要表现的慢性自身免疫病，目前病因未明，以手、足多个小关节的对称性、侵袭性炎症为特点，常伴有脏器受累，类风湿因子检测常呈阳性，未经系统有效治疗的患者最终可能会出现关节畸形和关节功能丧失，发病机制仍待进一步探究，目前已有研究证实IL-6、TNF-α等细胞因子在RA发病过程中发挥了重要作用[32-33]。

一项研究对RA患者CD14+单核细胞中的lncRNA表达情况的分析发现，IL-6和TNF-α参与调控不同的lncRNA转录，且TNF-α参与调控的lncRNA多于IL-6，表明lncRNA在RA发病过程中的转录调控具有一定的特异性[34]。对RA患者与正常人PBMC中lncRNA基因芯片分析表明，7个lncRNA(LUST、Hotair、antiNOS2A、MEG9、SNHG4、TUG1和NEAT1)表达明显上调，3个lncRNA(mascRNA、PR、PRINS和HOXA3as)表达明显下调[35]。

Song等[35]对RA患者血清外泌体和PBMC的研究发现，HOX转录反义RNA(HOX transcript antisense RNA, HOTAIR)表达明显上调，继而引起活化巨噬细胞迁移。而滑膜细胞和分化型破骨细胞中的HOTAIR表达却出现明显下调，并引起基质金属蛋白酶(metal matrix proteinase, MMP)-2和 MMP-13表达降低，提示HOTAIR用于RA发病机制研究及诊断的可能。

H19是另一类与RA密切相关的lncRNA[36]。有研究报道RA患者较健康人群、关节创伤患者和骨关节炎及反应性关节炎患者滑膜组织中的H19表达出现明显上调。通过微阵列分析RA患者和健康人群的骨髓细胞及血清发现，RA患者骨髓细胞中H19相对正常人高表达，而血清中H19与正常人对比差异无统计学意义[31,36]。

近期一项研究将RA患者与正常对照组T细胞对比发现，lncRNA LOC100506036和LOC100652951表达升高。而通过下调LOC100506036表达可引起酸性鞘磷脂酶1(sphingomyelin phosphodiesterase 1, SMPD1)及活化T细胞核因子1(nuclear factor of activated T cells 1, NFAT1)表达降低，提示LOC-100506036参与RA发病的可能机制[37]，也为治疗提供了新思路。生物制剂的使用可以下调RA患者T细胞中LOC100652951的表达[37]提示LOC100652951与RA发病密切相关。

既有研究证实基因TRAF1(TNF receptor asso-ciated factor 1)-C5区域的单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphism, SNP)位点与RA患者的遗传易感性有一定的相关性[38-39]，且TRAF1负调控TNF-α表达[40]。一项研究发现位于TRAF1和C5两编码基因之间的lncRNA-C5T1能调控RA患者滑膜成纤维细胞中C5的表达[41]。

此外，有研究发现，RA患者lincRNA-p21低表达，而NF-κB活化标志物表达却出现明显升高，进一步研究发现lincRNA-p21可能通过抑制NF-κB活性进而影响RA的发病过程[42]。该研究还发现甲氨蝶呤治疗RA不仅能显著改善患者状况，同时还能通过上调lincRNA-p21表达抑制NF-κB活化[42]，提示甲氨蝶呤对RA的治疗机制可能与lncRNA有关。此外，有研究发现紫草素能通过影响RA模型小鼠lncRNA-NR024118的表达来抑制炎症反应发生发展。这也为调节lncRNA治疗RA及相关机制研究提供更多的思路。

3.3 lncRNA与系统性红斑狼疮

系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus, SLE)是一种影响多个脏器功能的慢性自身免疫病。患者多为育龄期女性，临床症状多样，且早期症状往往不典型，为SLE的诊断及治疗带来不小的难度。

一项对SLE小鼠模型的研究[43]发现，生长抑制特异性转录本5(growth arrest-specific transcript 5, lncRNAGAS5)与SLE的发生有一定的相关性。GAS5的下调与GAS5启动子区域Sp1(specificity protein 1)结合位点的缺失有关，进而出现细胞凋亡抑制，自身抗原的暴露及自身抗体产生[43]。Mayama等[44]对SLE患者B细胞和CD4+T细胞的研究发现，细胞内GAS5的表达均出现下调。另一项研究发现SLE发病与GAS5在染色体1q25的位点有关[45]。除此之外，GAS5还具有抑制T细胞增殖的作用，表明GAS5可能通过影响T细胞水平从而在SLE的发病过程中发挥重要的作用。但GAS5因其结构能与糖皮质激素应答元件竞争性结合糖皮质激素受体，影响糖皮质激素的抗炎作用，故其减少是否会导致人体对糖皮质激素敏感性增加仍待进一步探究。

Ⅰ型IFN通路在SLE发病过程中起着重要的作用，一项研究发现，SLE患者外周血细胞lncRNA-NEAT1表达水平较正常对照组高，同时NEAT1水平与疾病活动度、肾脏受累及IFN积分有一定的相关性，考虑NEAT1可能通过IFN通路影响SLE疾病的发生发展[46]。Zhang等[47]对SLE患者的研究发现，NEAT1还可以通过MAPK通路促进CXCL10等趋化因子和IL-6等炎症因子的表达。

此外，Wu等[48]研究发现，linc0597和linc0949在SLE患者的PBMC中的表达较正常人和RA患者低，其中linc0949表达水平与SLE患者的疾病活动度、C3水平和肾脏受累等相关，同时在狼疮肾炎患者中lincRNA0949表达下调，提示linc0949可能成为SLE的生物标志物。另一项研究[49]显示SLE患者linc0949表达较正常人明显下调，linc0597的表达水平与正常人无明显差异。相关研究结果仍待进一步探究。

最近的一项研究[50]发现SLE患者血浆linc0597、lnc0640、lnc5150水平较HCs升高，而GAS5、lnc7074水平下降，并通过进一步研究证实血浆中的这5个lncRNA(GAS5, lnc7074, linc0597, lnc0640, lnc5150)组合作为SLE生物标志物的可行性。

4 展 望

近几年高通量测序技术应用的推广使得lncRNA家族的成员不断增加，而lncRNA在生物学研究领域也逐渐受到关注，其在免疫调节过程中发挥的作用也逐渐被认知，lncRNA参与调控免疫应答过程中多种细胞增殖、分化和功能进而导致疾病发生发展[51]。但目前对在风湿免疫病发病过程中起到重要作用的lncRNA及其作用机制的研究还相对较少，哪些lncRNA在风湿免疫病患者中存在异常，这些异常影响了哪些免疫细胞通路中的具体哪些环节，对免疫耐受的打破、抗原提呈细胞提呈自身抗原、对T细胞和B细胞的分化及活化、对免疫炎症效应阶段的调控，能否用于风湿免疫病的早期诊断和特异性、个体化治疗，仍有待进一步的探究。但相信随着科学技术的发展和关于lncRNA研究的进一步深入，有关lncRNA的研究一定能在风湿免疫病的预防和诊治过程中发挥重要的作用。