自身免疫性肝炎、原发性胆汁性胆管炎及其重叠综合征患者外周血OX40/OX40L的表达及意义

王维钊， 朱沁玲， 向晓星， 马 莉， 顾 达， 童 聪， 王婷婷，s何家俊， 刘 军， 王 璐, 陈超伍

1 江苏省苏北人民医院， 扬州大学临床医学院 a.内镜诊治中心； b.消化内科； c.风湿免疫检测中心，江苏 扬州 225001； 2 大连医科大学 研究生院， 辽宁 大连 116044

ExpressionandsignificanceofOX40/OX40Linperipheralbloodofpatientswithautoimmunehepatitis,primarybiliarycholangitis,andtheiroverlapsyndrome

WANGWeizhao1a,ZHUQinling1b,2,XIANGXiaoxing1b,MALi1b,GUDa1b,TONGCong1b,WANGTingting1b,2,HEJiajun1b,2,LIUJun1a,WANGLu1a，CHENChaowu1a.

(1.a.CenterofEndoscopicDiagnosisandTreatment,b.DepartmentofGastroenterology,c.CenterofRheumatologyandImmunology,SubeiPeople’sHospitalofJiangsu&ClinicalMedicalCollegeofYangzhouUniversity,Yangzhou,Jiangsu225001,China;2.GraduateSchool,DalianMedicalUniversity,Dalian,Liaoning116044,China)

Abstract:ObjectiveTo investigate the expression and clinical significance of OX40/OX40L (CD134/CD134L) in CD4+T cells, CD8+T cells, monocytes, and B lymphocytes in peripheral blood of patients with autoimmune hepatitis (AIH), primary biliary cholangitis (PBC), and their overlap syndrome before and after standardized treatment.MethodsA total of 74 patients with AIH, PBC, and their overlap syndrome who were diagnosed in Subei People’s Hospital of Jiangsu from August 2015 to August 2019 were enrolled, and according to related diagnostic criteria, they were divided into AIH group (group A) with 29 patients, PBC group (group P) with 26 patients, and overlap syndrome group (group C) with 19 patients. A healthy control group with 30 individuals was also established. Peripheral blood samples were collected before and after standardized treatment to measure the expression of OX40/OX40L on the surface of peripheral blood cells by immunofluorescence flow cytometry, and the expression of OX40/OX40L was compared before and after treatment and between the three groups and the healthy control group to investigate its clinical significance. A one-way analysis of variance was used for comparison between multiple groups, and the least significant differencet-test was used for further comparison between two groups; the pairedt-test was used for comparison of paired samples between two groups.ResultsThere were no significant differences in sex composition and age composition between the three groups (P>0.05). Before treatment, the positive rate of OX40 in peripheral blood CD4+T cells gradually increased in groups A, P, and C, and groups A, P, and C had a significantly higher positive rate of OX40 than the control group (14.80%±4.99%/17.11%±2.71%/25.18%±5.55% vs 6.67%±2.26%,F=14.823,P<0.001); groups A, P, and C had a significantly higher positive rate of OX40 in CD8+T cells than the control group (4.86%±1.54%/6.40%±1.88%/7.33%±2.12% vs 4.09%±2.69%,F=5.486,P<0.001); the positive rate of OX40L in CD14+monocytes was 19.84%±6.11% in group A, 21.17%±4.35% in group P, 29.13%±6.32% in group C, and 4.86%±2.34% in the control group, and there was a significant difference between groups (F=17.004,P<0.001); the positive rate of OX40L in CD19+B cells was 17.62%±3.86% in group A, 14.75%±4.32% in group P, 10.13%±2.56% in group C, and 4.50%±1.38% in the control group, showing a trend of gradual reduction, and groups A, P, and C had a significantly higher positive rate than the control group (F=12.221,P<0.001). After treatment, the positive rate of OX40 in CD8+T cells decreased significantly to a similar level as the control group, and there was no significant difference between groups (F=0.731,P=0.538). For the other three types of cells, although there were varying degrees of reduction in the positive rate of OX40/OX40L after treatment, groups A, P, and C still had a significantly higher positive rate than the control group; in CD4+T cells, the positive rate of OX40 was 11.00%±1.98% in group A, 13.72%±1.03% in group P, 19.72%±3.47% in group C, and 6.67%±2.26% in the control group, and groups A, P, and C had a significantly higher positive rate than the control group (F=11.365,P<0.001); in CD14+monocytes, the positive rate of OX40L was 11.82%±2.23% in group A, 15.19%±4.42% in group P, 24.51%±4.09% in group C, and 4.86%±2.34% in the control group, and groups A, P, and C had a significantly higher positive rate than the control group (F=13.748,P<0.001); in CD19+B cells, the positive rate of OX40L was 9.09%±3.25% in group A, 6.81%±2.20% in group P, 7.48%±2.85% in group C, and 4.50%±1.38% in the control group, and groups A, P, and C had a significantly higher positive rate than the control group (F=8.052,P<0.001). Groups A, P, and C had significant reductions in the expression of OX40/OX40L in peripheral blood CD4+T cells, CD8+T cells, CD14+monocytes, and CD19+B lymphocytes after treatment (allP<0.05).ConclusionThe expression of OX40/OX40L in peripheral blood increases in patients with AIH, PBC, and their overlap syndrome and decreases after treatment, indicating that the OX40/OX40L pathway is involved in the pathogenesis of the above diseases, and the role of OX40 on the surface of CD8+T cells may better reflect the treatment outcome.

Keywords：hepatitis, autoimmune; primary biliary cholangitis; overlap syndrome; receptors, OX40; OX40 ligand

自身免疫性肝病是一组自身免疫功能紊乱导致的以肝脏为靶器官损害的自身免疫病，主要包括自身免疫性肝炎(AIH)、原发性胆汁性胆管炎(PBC)、原发性硬化性胆管炎(PSC)，以及其重叠综合征，多见于女性。其中AIH、PBC、AIH重叠PBC较为常见，目前此三种疾病发病机制尚不完全明确，当前的研究认为其发病与免疫紊乱、遗传、环境因素相关。T、B淋巴细胞的异常激活，及单核巨噬系统的活化，导致T淋巴细胞功能亢进，B淋巴细胞异常分泌自身抗体，单核巨噬细胞系统分泌炎性细胞因子，参与了其发病。而T淋巴细胞的活化需要第一与第二协同刺激信号及专职抗原递呈细胞的参与[1-3]。OX40 (CD134)及其配体OX40L(CD252、CD134L)是肿瘤坏死因子受体超家族的成员，它们的结合能为上述细胞活化提供协同刺激信号，其中，OX40表达于活化的CD4+、CD8+T淋巴细胞表面，OX40L主要表达于活化的B淋巴细胞、单核细胞、巨噬细胞。OX40/OX40L信号通路结合活化后，能促进CD4+T淋巴细胞迁移、增殖、分化和记忆性CD4+T淋巴细胞的产生，增强CD8+T淋巴细胞功能，而迁移的CD4+T淋巴细胞可辅助B淋巴细胞的成熟及自身抗体的产生，OX40/OX40L与多种自身免疫病的发生发展密切相关[4-7]，但目前尚缺乏OX40/OX40L在AIH、PBC及其重叠综合征作用的相关研究，本研究通过检测OX40/OX40L在上述3种疾病患者外周血淋巴单核细胞的表达，探讨其临床意义。

1 资料和方法

1.1 研究对象 选取2015年8月-2019年8月在江苏省苏北人民医院门诊及住院就诊的AIH、PBC及其重叠综合征患者74例，留取患者外周血并按照各自诊断标准分为AIH组(A组，n=29)、PBC组(P组，n=26)、重叠综合征组(C组，n=19)并随访，随访时间≥6个月，经标准治疗、实验室指标缓解后再次留取外周血(治疗后A组、治疗后P组、治疗后C组)。其中AIH诊断标准参考国际自身免疫性肝病工作小组(IAIHG )2008年提出的AIH简化诊断积分系统[8]。PBC的诊断符合2015年由中华医学会制订的《原发性胆汁性肝硬化(又名原发性胆汁性胆管炎)诊断和治疗共识(2015)》[9]。重叠综合征缺乏诊断标准，目前采用Chazouillères等[10]在1998年提出的巴黎标准，IAIHG于1999年提出修订的诊断积分系统[11]。对于上述诊断标准，有针对中国人群的研究[12]显示, 使用巴黎标准诊断AIH-PBC重叠综合征敏感度为20%，特异度为100%，修订的诊断标准联合PBC诊断标准诊断重叠综合征，敏感度为60%，特异度为87.3%。使用2008年IAIHG 提出的简化AIH诊断积分系统联合巴黎标准中PBC诊断标准诊断重叠综合征，敏感度为90%，特异度为98.2%，并且操作简便。本研究采用简化积分系统诊断AIH-PBC重叠综合征。由于AIH-PSC、PSC-PBC重叠发病率低，本研究未纳入。同时设置健康对照30例，对照组选取苏北人民医院体检中心健康体检志愿者，均排除自身免疫性疾病，以及近期不存在感染、年龄和性别构成与本研究相近患者。

1.2 实验资料 小鼠抗人单克隆抗体：CD4-PE、CD8-FITC、CD14-APC、CD19-FITC、OX40-APC、OX40L-PE购于美国Biolegend公司，红细胞裂解液、流式细胞仪、离心机采用美国Beckman Coulter公司产品。

1.3 实验方法 (1)采集上述患者及对照组外周血2 ml，行EDTA抗凝；(2)取两只流式细胞分析试管，分别加入全血50 μl，按照流式细胞抗体说明书分别加入适量CD4-PE、CD8-FITC、OX40-APC，CD14-APC、CD19-FITC、OX40L-PE抗体，混匀后室温避光孵育15 min，(3)加入裂红素1 ml，充分震荡，室温避光孵育12 min，(4)1000 r/min离心5 min，弃上清；(5)加入PBS 500 μl震荡混匀，1000 r/min离心5 min，弃上清；(6)加入PBS 200 μl，震荡混匀，上机行流式细胞术检测。

2 结果

2.1 基本资料 A、P、C 3组患者女性比例分别为93.1%、88.4%、89.5%，差异无统计学意义(χ2=1.442，P=0.47)。3组患者年龄分别为(54.74±8.36)岁、(54.43±9.71)岁、(51.1±6.7)岁，差异无统计学意义(F=0.13，P=0.88)。

2.2 治疗前OX40/OX40L表达水平 在CD4+T淋巴细胞中，C组OX40阳性率最高[(25.18±5.55)%]，其次为P组[(17.11±2.71)%]，而A组最低[(14.80±4.99)%]，但均高于对照组[(6.67±2.26)%]，组间差异有统计学意义(F=14.823，P<0.001)；在CD8+T淋巴细胞中，C组OX40阳性率最高[(7.33±2.12)%]，其次为P组[(6.40±1.88)%]，而A组最低[(4.86±1.54)%]，但均高于对照组[(4.09±2.69)%]，组间差异有统计学意义(F=5.486，P<0.001)；在CD14+单核细胞中亦发现同样的规律，A、P和C组OX40L阳性率依次为(19.84±6.11)%、(21.17±4.35)%和(29.13±6.32)%，均高于对照组[(4.86±2.34)%]，组间差异有统计学意义(F=17.004，P<0.001)；但是在CD19+B淋巴细胞中，A、P和C组的OX40L阳性率呈现逐渐降低趋势，分别为(17.62±3.86)%、(14.75±4.32)%和(10.13±2.56)%，均高于对照组[(4.50±1.38)%]，组间差异有统计学意义(F=12.221，P<0.001)(图1、2)。

2.3 治疗后OX40/OX40L表达水平 经治疗实验室指标缓解后再次检测，共成功随访63例患者，A组27例，P组22例，C组14例。在CD4+T淋巴细胞中，A、P、C组的OX40阳性率依次为(11.00±1.98)%、(13.72±1.03)%和(19.72±3.47)%，均高于对照组[(6.67±2.26)%]，组间差异有统计学意义(F=11.365，P<0.001)；在CD8+T淋巴细胞中， A、P、C组的OX40阳性率依次为(3.72±1.78)%、(4.29±1.29)%和(5.08±2.46)%，接近于对照组水平[(4.09±2.69)%]，差异无统计学意义(F=0.731，P=0.538)。在CD14+单核细胞中，A、P、C组的OX40L阳性率依次为(11.82±2.23)%、(15.19±4.42)%和(24.51±4.09)%，均高于对照组[(4.86±2.34)%]，组间差异有统计学意义(F=13.748，P<0.001)；在CD19+B淋巴细胞中，A、P、C组的OX40L阳性率依次为(9.09±3.25)%、(6.81±2.20)%和(7.48±2.85)%，均高于对照组[(4.50±1.38)%]，组间差异有统计学意义(F=8.052，P<0.001)(图1、3)。

2.4 治疗前后OX40/OX40L表达比较 取成功随访患者治疗前后数据比较，行配对样本t检验，A、P、C组OX40/OX40L在外周血CD4+T淋巴细胞、CD8+T淋巴细胞、CD14+单核细胞、CD19+B淋巴细胞的表达在治疗后均明显下降，差异均有统计学意义(A组，t值分别为2.82、2.39、3.53、3.60，P值分别为0.013、0.030、0.008、0.006；P组，t值分别为3.51、3.02、2.48、3.71，P值分别为0.009、0.011、0.029、0.005；C组，t值分别3.01、2.06、2.80、2.17，P值分别为0.011、0.042、0.018、0.037)(图2、3)。

3 讨论

OX40/OX40L是英国牛津大学Paterson等[13]在1987年发现的小鼠活化CD4+T淋巴细胞表面的一种标志物，命名为OX40。属于肿瘤坏死因子受体超家族，相对分子质量为50 000的Ⅰ型跨膜糖蛋白，主要在活化的CD4+和CD8+T淋巴细胞上表达。其配体OX40L是相对分子质量为34 000～40 000的Ⅱ型跨膜糖蛋白，可诱导性地表达于单核、巨噬细胞、B淋巴细胞、树突状细胞等专职的抗原递呈细胞上。OX40/OX40L信号通路激活后，可促进CD4+T淋巴细胞迁移、增殖、分化和记忆性CD4+T淋巴细胞的产生，而迁移的CD4+T淋巴细胞可辅助B淋巴细胞的成熟及自身抗体的产生，OX40/OX40L与多种自身免疫病(如类风湿关节炎、系统性红斑狼疮、干燥综合征等)的发生发展密切相关[4,7,14]，目前有OX40/OX40L在多种自身免疫性疾病的作用研究，但在AIH、PBC及其重叠综合征的研究尚缺乏，因此围绕上述患者外周血OX40/OX40L的表达进行研究，探讨作用机制可能对开发崭新诊治方案存在潜在价值[7,15]。

本研究3组患者均以50岁以上中年女性为主，性别年龄构成差异无统计学意义，和文献[3,16]报道相符。本实验显示OX40在AIH、PBC及其重叠综合征患者的外周血CD4+T淋巴细胞中高表达，且3组均较对照组明显升高，经治疗后下降，但仍高于对照组，说明在此3种疾病中，OX40在CD4+T淋巴细胞表达活跃。经查阅相关文献，在AIH、PBC及其重叠综合征患者中，发现各类型T淋巴细胞数量存在失衡(如Treg/Th17失衡)，功能紊乱，而总体CD4+T淋巴细胞功能是被强化的[17-18]。Webb等[19]的研究显示在AIH、PBC及其重叠综合征患者肝脏病理标本上可见大量CD4+T淋巴细胞浸润，表明CD4+T淋巴细胞参与了其发病。Sitrin等[20]报道，OX40/OX40L结合活化后，可在功能上促进CD4+T淋巴细胞活化增殖分化，对CD4+T淋巴细胞起到正向作用，并且发现，在系统性红斑狼疮及狼疮性肾炎中，OX40/OX40L信号通路活化后可通过增强CD4+T淋巴细胞的功能加重疾病进展。OX40/OX40L还通过增加OX40+CD4+T淋巴细胞的表达，产生高水平炎症因子，加重类风湿关节炎，而抑制OX40通路后，促炎反应被显著降低[21]。本研究也显示AIH、PBC及其重叠综合征患者的OX40在CD4+T淋巴细胞中高表达，而经糖皮质激素、免疫抑制治疗后，OX40表达显著下降，表明在上述疾病中，CD4+T淋巴细胞功能活跃，并且OX40/OX40L是导致CD4+T淋巴细胞功能强化，促进疾病发生发展的幕后有力助手之一，标准化治疗能抑制OX40/OX40L在CD4+T淋巴细胞的作用，缓解该类患者病情。

本研究治疗前CD8+T淋巴细胞的OX40阳性率在AIH、PBC及其重叠综合征患者中均高于对照组，其中C组最高；治疗后3组OX40阳性率均下降到健康人群相近水平，表明OX40在CD8+T淋巴细胞的表达经治疗后更容易下降。当患者肝功能、免疫球蛋白经治疗后好转时，OX40在CD8+T淋巴细胞的表达降至正常水平，说明OX40/OX40L在CD8+T淋巴细胞的作用对治疗更敏感，能更好的反应疗效。有研究[3]发现CD8+T淋巴细胞在AIH、PBC及其重叠综合征中发挥着重要作用。Miao等[22]研究显示，AIH患者病理上可见大量CD8+T淋巴细胞浸润，并且可见大量肝细胞坏死，CD8+T淋巴细胞主要介导肝细胞凋亡。表明CD8+T淋巴细胞在其病程中发挥着重要作用。而OX40/OX40L如何作用于CD8+T淋巴细胞，在上述疾病中如何发挥作用，值得进行更大样本、更深入的研究。

CD14+单核细胞、CD19+B淋巴细胞的OX40L阳性率在AIH、PBC及其重叠综合征患者中治疗前后均比对照组高。治疗前后AIH、PBC及其重叠综合征患者的OX40L在CD14+单核细胞、CD19+B淋巴细胞的表达均下降，差异存在统计学意义(P<0.05)。在免疫反应中，单核巨噬细胞、B淋巴细胞可作为专职抗原递呈细胞，参与T淋巴细胞活化，为其提供活化信号，促进免疫应答，同时，也可分泌炎性细胞因子、抗体，参与免疫反应。OX40/OX40L结合活化后，可增强CD4、CD8+T淋巴细胞的功能，同时活化的CD4+T淋巴细胞可辅助B淋巴细胞的成熟及自身抗体的产生[4]。通过查阅文献发现，AIH、PBC及其重叠综合征患者体内存在不同程度的IgG、IgM等免疫球蛋白升高[23-24]。本研究中上述患者外周血检测OX40L在CD14+单核细胞、CD19+B淋巴细胞表达较对照组升高明显，而经治疗后下降。结合上述OX40的高表达情况，表明OX40/OX40L信号通路作用于CD14+单核细胞 、CD19+B淋巴细胞，为T淋巴细胞活化、增殖、分化提供了协同刺激信号，而活化的T淋巴细胞，再次通过OX40/OX40L通路作用于CD14+单核细胞、CD19+B淋巴细胞，增强炎症因子及自身抗体产生，参与AIH、PBC及其重叠综合征的发病。

综上所述，OX40/OX40L在AIH、PBC及其重叠综合征患者外周血各细胞表达升高，经治疗后下降，参与了其发病机制。然而目前AIH、PBC及其重叠综合征难以治愈，现有治疗手段治疗周期长，需要长期服药，疗效尚有很大的提升空间，在治疗方法上，亟待全新的研究突破以及新的治疗手段。因此，围绕OX40/OX40L在上述疾病中的作用展开深入研究，充分阐明其机制，以开发出新的药物，为该类患者的治疗开创崭新的篇章。

利益冲突声明：本研究不存在研究者、受试者监护人以及与公开研究成果有关的利益冲突，特此声明。

作者贡献声明：向晓星、马莉主要负责课题设计，拟定写作思路，指导撰写文章并最后定稿；王维钊、朱沁玲、马莉主要负责收集数据，完成实验，资料分析，撰写论文并修改论文；顾达、童聪、王婷婷、何家俊、刘军、王璐、陈超伍参与收集数据，修改论文。