酶联免疫吸附试验应注意的几点事项

张慧瑛 宁德市蕉城区畜牧兽医站 福建宁德 352100

酶联免疫吸附试验简称为ELISA，具有灵敏度高、特异性强、快速简便、准确等优点。ELISA是基层兽医实验室最为常见的一种检测技术，但该试验对操作要求比较高，一些细节操作不当就会对试验结果的准确性造成很大的影响。笔者以多年来从事基层兽医实验室检测工作的经验，就ELISA试验中应注意的几点事项作如下探讨，以供同行参考。

1 试验前的准备

1.1 样品 ELISA试验中使用较多的是血清样品。在全血采集时，采血过程要求无菌，同时避免出现溶血现象。离心后的血清，短期可置于4℃保存；短时间内无法及时检测的，应置于-20℃保存，避免反复冻融。

1.2 试剂 所有试剂、反应板在使用之前应恢复至室温。回温前，应先查看试剂盒是否在有效期内；此外，还需检查试剂的状态是否正常，如TMD底物是否已经显色变质。使用过期或变质的试剂会影响检测结果。

1.3 试验操作 当前基层兽医实验室为了保证结果的准确性，所使用的试剂盒除了国产外，还有使用进口试剂盒。试剂品种较多，因生产厂家不同，从而操作方法不同；有的同一厂家同一病种不同批号的试剂盒，操作方法亦有不同。因此，试验前一定要先熟悉步骤，避免因操作错误而导致试验失败，或因不熟悉步骤，操作时间过慢而影响试验结果。

1.4 试剂配制 每个试剂盒对试剂的配制要求不同，有的需要配制样品稀释液，稀释阴阳性血清、被检样品和洗液，有的只需要稀释洗液，稀释前检查溶液是否有结晶析出，若有需用水浴锅或恒温培养箱融化，再根据说明书上要求的稀释倍数进行稀释，配制试剂应现配现用。

1.5 环境 试验前应通过空调来调节实验室温度，保证在恒温状况下 （23～25℃）进行，并做好相关记录。

2 试验操作

2.1 加样 加样是ELISA试验中操作最多的一个步骤。每次加样前应充分混匀；使用多孔道移液器时，要注意每道的吸液量是否一致，如若不一致要进行调节；加样应加在板孔底部，速度要均匀，不能打得过快，避免产生气泡或飞溅至孔外；加不同样品时要更换吸嘴，避免交叉污染；加样的时间尽量缩短，尤其到显色阶段对时间要求较高；加样过程中要专心，避免出现少加、多加、错加、漏加、重复加等现象。

2.2 孵育 对环境条件进行控制。进口试剂盒对温度的要求较低，只需室温即可；国产试剂盒则要求37℃；此外，加底物溶液时需在暗室环境下进行；可利用培养箱、冰箱、湿盒等设备调节孵育温度、湿度。反应板要求平放，若多个板一起孵育，切不可叠放，避免因受热不均影响试验结果。

2.3 洗板 洗板是ELISA操作中很重要的一步，虽不是反应步骤，但往往决定试验的成败。一般用300 μL洗液注满每孔，洗涤3~5次，最后1次洗涤后进行拍干。洗板方式有两种：一是基层最常用的人工洗板；二是使用洗板机洗板。人工洗板要求较高，与加洗涤液及甩板手法有关。检测样品数量多时可用洗板机洗板，使用前应对洗板机进行检查、清洗，确保洗涤时不出现失误。在洗板过程中，应避免液体溅出造成的反应孔交叉污染，洗板时间不宜过长，应避免反应孔底部包被结合物变干。

2.4 读板 读板前应提前预热酶标仪半个小时，严格按操作说明进行波长设置。加完终止液后，应尽快放入酶标仪读数，时间尽量控制在2 min以内。放入酶标仪读数前，注意检查反应板的朝向；同时，拿反应板的过程中应轻拿轻放，避免反应孔中的液体飞溅出来，既影响试验结果，又污染酶标仪。

3 试验结果的判定分析

试验完成后要对结果进行判定并分析原因。若试验不成立，要查找是否存在试剂盒变质、操作顺序有误、孵育时间、温度未按要求进行等。即使试验成立，还应对比阴阳性OD值，若阴性或阳性对照数值的重复性较差，应考虑是否存在加样量不准确、洗板操作不当等问题。

4 讨 论

ELISA试验操作虽然简单方便，但不可掉以轻心，稍有不当就会直接影响试验结果。因此，操作前要做好相关准备、熟悉操作步骤，操作时专心认真、做好标记，最后对试验结果进行判定分析。日常定期校准移液器，做好酶标仪等仪器设备的维护与保养。