鼓膜修补材料的研究进展*

王冰 舒易来 陈兵

鼓膜 (tympanic membrane，TM)是一种半透明的菲薄结构，由角质化的鳞状上皮外层、纤维状中层和粘膜内层三层结构组成[1]。造成鼓膜穿孔的最常见病因有外伤、中耳炎和鼓膜置管术遗留的造口等。虽然大多数急性鼓膜穿孔是可以自愈的，但面积较大的穿孔或慢性穿孔需要外科手术干预才能修复。穿孔的鼓膜如果不能及时愈合，失去了阻挡外界细菌进入中耳的有效屏障，中耳感染的几率将大大增加，严重者还会引起耳溢液、传导性听力下降甚至胆脂瘤的形成等，造成严重的并发症。鼓膜穿孔的自愈通过上皮细胞的移行而完成，但常缺少纤维中间层，相较于正常鼓膜，自愈后的鼓膜更加脆弱、传声性能不理想、较易形成内陷袋，并且在一定的气压伤时有再次穿孔的可能。因此，重建类似原生鼓膜的三层结构是十分必要的。

目前，虽有多种鼓膜修补材料和术式可供选择，但对于修补鼓膜的最佳材料仍未达成共识，鼓膜修复手术也存在一定的禁忌症和并发症[2]。常用的修复鼓膜穿孔的手术主要有鼓室成形术和鼓膜成形术，鼓膜成形术作为鼓室成形术的重要内容之一，与其他手术，如：听骨链成形术等，组合构成多种类型的单纯性鼓室成形术，也可与各种类型的乳突切除术构成多种类型的乳突切除伴鼓室成形术。既往鼓膜修补使用的材料有消毒后的纸片、软硅胶、脂肪或明胶海绵等，但这类材料修复鼓膜的有效性存在差异[3，4]。目前最常见的是利用耳后颞肌筋膜或软骨膜自体移植，成功率较高，但也有再次穿孔的可能[5]。

鼓室成形术多需在全身麻醉下完成，手术成本较高，显微手术的难度对耳外科医生也是一种挑战[6]，术后发生鼓膜再次穿孔可能需要再次手术修复，反复自体取材可能还会导致供区的组织病变，使自体移植材料的可用性变差[7]。为了解决以上问题，用于鼓膜修补的新型辅助材料和组织工程技术已应用于实验和临床，以替代患者自体取材移植[4]。组织工程的基本方法包括支架结构材料、生物因子和干细胞等；理想的支架材料可为细胞附着、生长和发挥正常功能提供良好的环境，生物信号分子和生长因子有助于增强细胞功能和促进整体组织的生长[8]。本文就鼓膜修补的组织工程学材料的研究进展进行综述。

1 结构材料

通常结构材料包括脱细胞组织和聚合物[1]，目前已有多种具有优良特性的结构材料供鼓膜穿孔修复手术选择，比如：细胞外基质、交联水凝胶、蚕丝纤维蛋白等等。

1.1细胞外基质 细胞外基质(extracellular matrix，ECM)是天然来源的材料，由多细胞生物的细胞合成并分泌到细胞外，分布在细胞表面或细胞之间的大分子，可以为组织工程和再生医学提供具有诱导性的支架材料[8]，这些支架的结构和功能蛋白可作为鼓膜重建和组织特异性修复的模板。

膀胱细胞外基质可以用作鼓膜修补的组织工程支架材料。Parekh等[9]将猪的膀胱经去细胞化处理产生膀胱基质，然后作为贴片材料用于诱导鼓膜穿孔的修复；膀胱基质贴片治疗组和对照组(自然愈合组)愈合后的鼓膜均较原生鼓膜厚，但前者鼓膜组织学分析显示为更透明、均匀的结构，而对照组自然愈合后的新生鼓膜有小囊泡和纤维结节等不均匀区域；由于样本量较小，无法进行有意义的统计分析。此外，此研究缺乏对细胞提取后获取的膀胱基质这一修补材料的表征描述和相关特性的研究。

Deng等[10]在2009年利用猪真皮和硬脑膜进行脱细胞处理，获得无细胞的ECM支架，然后从豚鼠鼓膜中分离鼓膜成纤维细胞进行接种，并且建立豚鼠鼓膜慢性穿孔的模型用于验证这种材料的有效性；显微镜下观察和组织学检查显示，随着时间推移该支架能成功诱导成纤维细胞的生长并使鼓膜愈合，并且组织切片染色结果显示愈合的鼓膜具有与正常鼓膜相似的三层结构，听性脑干反应(ABR)测试也显示修复后的听力有所提高[10]。随着细胞提取技术的成功，脱细胞材料的生物相容性得到了充分的证明，异种生物材料可以用于鼓膜的组织工程学研究，利用此类移植物材料也可以减少手术时间和成本。另外，有国外文献报道了对比脱细胞真皮与颞肌筋膜作为鼓膜移植物材料的疗效[11]，对40例患者进行前瞻性随机非盲试验，实验组采用厚度0.03 mm的脱细胞真皮、对照组采用颞筋膜修补鼓膜；结果显示实验组手术时间较对照组明显缩短且术后疼痛也明显减轻，同时两组移植成功率及听力结果无明显差异。这项研究将脱细胞真皮与临床上最常用的自体组织作比较，十分有意义，但这项研究并非双盲试验，并且使用脱细胞真皮之类的新型移植物材料也存在着成本问题。

1.2交联水凝胶 目前为止，已有多种水凝胶和海绵材料应用于组织工程学研究，此类材料来源于糖胺聚糖，具有促进伤口愈合和加速上皮化的能力，在修补组织缺损伤口的领域得到了广泛应用[12]。Park等[13]在豚鼠急性鼓膜穿孔模型中比较了多种合成交联水凝胶的疗效，分别为Carbylan-SX、Gelatin-DTPH-PEGDA、Carbylan-S/GelatinDTPH、明胶海绵、外延膜、交联硫代硫酸软骨素，结果表明Carbylan-S/Gelatin-DTPH水凝胶、明胶海绵和硫代硫酸软骨素修复的鼓膜穿孔愈合时间最短，其中硫酸软骨素修补组出现了较强的炎症反应。Hakuba等[14]用水凝胶结合成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor, bFGF)对豚鼠急性鼓膜穿孔进行修补，结果bFGF处理组修复率较高，并且形成了与原生鼓膜相似的三层结构，而对照组(生理盐水组)仅有粘膜层和上皮层的再生。

1.3蚕丝 丝素是蚕丝中含有的一种具有弹性、可降解性和生物相容性的蛋白质聚合物，这种特性使得蚕丝已被用于鼓膜组织工程学的支架材料研究[15, 16]。2010年，Ghassemifar等[15]在含血清培养基中，分别在蚕丝蛋白贴片(取自家蚕)和组织培养塑料薄膜(对照组)上培养人类鼓膜细胞15天，结果表明，与对照组相比，蚕丝蛋白贴片支持的鼓膜细胞生长计数水平要高于对照组，并且免疫荧光化学分析明确表明，蚕丝蛋白贴片组支持的细胞之间的接触与粘附情况也优于对照组；所以认为蚕丝蛋白是一种更适合于人类鼓膜细胞的支架材料，可以应用于鼓膜组织工程学研究[15]。但是上述研究仅限于体外细胞的培养，而缺乏有效的体内模型验证。Kim等[16]对大鼠急性鼓膜穿孔模型进行修补处理，一侧耳用蚕丝贴片修补，对侧耳用纸贴片进行修补，结果示蚕丝贴片与纸贴片处理的鼓膜穿孔平均愈合时间分别为7.2天和9.1天，有统计学差异，组织学分析显示，蚕丝贴片修补组有与天然鼓膜更相似的结构[16]。此外，Levin等[17,18]对丝素对鼓膜再生的影响进行了研究，体外研究表明蚕丝贴片可以支持人类鼓膜角质形成细胞的增殖和粘附。总的来说蚕丝可作为一种较为理想的天然材料用于鼓膜穿孔的修补。

2 影响鼓膜再生的生长因子

目前已有多种生长因子被广泛用于鼓膜穿孔愈合的研究,其中被广泛研究的生长因子有表皮生长因子[19～21]、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)[22～25]、透明质酸(HA)[26,27]，且大多数研究表明，这些生物因子对鼓膜的再生有显著疗效。

2.1透明质酸 透明质酸(hyaluronic acid，HA)是一种具有粘弹性的天然胞外多糖物质[28]。MeroGel 是一种商业可用的酯化透明质酸,Ozturk等[29]建立大鼠急性鼓膜穿孔模型来评估MeroGel和HA的有效性,结果显示，MeroGel和HA处理组的鼓膜穿孔愈合率明显高于对照组，并且这两组效果无明显差异；免疫组化分析结果示，MeroGel和HA处理组的成纤维细胞生长因子(FGF)和血管内皮生长因子(VEGF)含量明显升高，所以MeroGel被认为是一种较为理想的鼓膜修补材料。

2.2表皮生长因子 Ramalho等[30]在亚急性鼓膜穿孔的栗鼠模型中研究表皮生长因子(epidermal growth factor, EGF)和己酮可可碱的作用，己酮可可碱是一种能够增加局部微循环缺陷组织血流量和氧张力的药物；实验分为4组：对照组(n=9)：外用蒸馏水；A组(n=8)：局部外用EGF；B组(n=13)：口服己酮可可碱，每12小时10 mg/kg，连续10天；D组(n= 10)：外用EGF + 己酮可可碱。每组每隔72小时给药一次，持续10天，所有动物均在鼓膜穿孔处放置可吸收的明胶海绵。结果鼓膜愈合率分别为：对照组8.7%，A组30.3%，B组3.6%，D组16.5%，提示EGF促进了鼓膜愈合，但是己酮可可碱没有显示出积极的结果，EGF和己酮可可碱之间也并无协同作用。此外，还有研究[31]对大鼠进行急性鼓膜穿孔造模后，分别用浸泡过透明质酸和EGF的明胶海绵修复穿孔，结果显示，与自然愈合的鼓膜穿孔相比，HA和EGF明显缩短了鼓膜愈合的时间，但是HA和EGF两组间差异不显著；在组织病理学检查中，治疗组与对照组在鼓膜厚度、新生血管生成等方面亦无明显差异。可见，表皮生长因子能够有效促进鼓膜穿孔的愈合。

2.3血小板源性生长因子(platelet derived growth factor,PDGF) 血小板源性生长因子和血管内皮生长因子(vascular endogrowth factor, VEGF)形成了一个具有高度保守性的PDGF/VEGF同源结构域，目前在鼓膜修补方面，关于PDGF和VEGF的研究还较为有限。Yeo等[32]研究了PDGF在鼓膜穿孔修补中的应用，分别用PDGF(实验组)和磷酸盐缓冲液(对照组)处理大鼠急性鼓膜穿孔，结果示PDGF组穿孔鼓膜较对照组更快愈合，且组织学检查显示PDGF组处理后的新生鼓膜更接近原生鼓膜的三层结构。Roosli等[33]首次在临床试验中研究PDGF对鼓膜再生的作用，对20例鼓膜穿孔患者随机进行PDGF局部治疗(用PDGF浸泡的消毒纸片处理穿孔鼓膜)和安慰剂治疗，治疗6周，结果显示PDGF治疗组与对照组相比没有显示任何优势。血小板源性生长因子对鼓膜穿孔愈合的研究目前较为有限，还有待更多的探索。

3 干细胞

用于鼓膜生物工程研究的细胞可以从原始组织、细胞系或干细胞中获得，这些细胞可以在植入前注射或在体外植入[34]。目前，用于生物支架研究的细胞研究较为有限,除了上述已提及的Deng等[10]的研究外，von Unge等[35]在沙鼠急性鼓膜穿孔模型中，应用小鼠胚胎干细胞处理鼓膜穿孔，结果显示小鼠胚胎干细胞能够改善鼓膜愈合。然而，当此法应用于大鼠模型中时，未发现胚胎干细胞对鼓膜穿孔愈合起到促进作用； 6个月后观察修复后的鼓膜，处理组和未处理组新生鼓膜强度和刚度相似，但干细胞处理组鼓膜中层较厚[36]。随后，此研究组又进一步将人间充质干细胞应用于豚鼠慢性鼓膜穿孔模型，结果显示人间充质干细胞处理后的鼓膜穿孔愈合率为40%，未处理组愈合率仅为10%；但免疫抑制剂(他克莫司)处理组呈现出愈合不良，并且中耳腔充满了炎性肉芽和组织粘连[37]。近年的研究发现，人类的鼓膜祖细胞在鼓膜脐部、鼓环以及锤骨柄部位，表明这些部位具有再生鼓膜干细胞的可能[38]。

干细胞在促进鼓膜再生方面显示出了巨大潜能，经过处理的干细胞结构与原生鼓膜的结构似乎十分相似，这对于鼓膜修复、重建听功能和防止再次穿孔至关重要。然而，干细胞治疗也存在伦理和成本方面的问题；因此，未来其他来源的细胞，如：自体角质形成细胞也将成为重要研究方向。

4 展望

总的来说，各种原因导致的鼓膜穿孔在临床上十分常见，严重影响患者生活质量。目前对鼓膜穿孔修复的研究包括生物材料、生物因子、干细胞以及各种术式的选择，存在各种挑战，比如：生物材料的性能有待优化，从而能适配鼓膜原有的生物力学和声学特性；脱细胞基质的选择可能会涉及伦理问题，需要对患者充分告知；各种修复材料等尚需要进一步的研究和应用。随着各种新型材料的出现和改进，各种研究的不断深入和临床应用终将对这一领域带来光明的前景。