微生物推动下的胶原生物工程发展现状

董彦博，张正衍*，程 岳，马识婷，吴 怡，艾力西尔·艾斯克尔，周亚丽，王 忠

（兰州大学第二临床医学院，甘肃 兰州 730030）

胶原蛋白是哺乳动物中含量最丰富的蛋白质，在细胞外基质的结构、分子和细胞相互作用中起着关键作用。胶原蛋白具有独特的分子结构，即胶原三螺旋结构。这种结构由一个超螺旋的三螺旋组成，它是由三个左旋的聚线型链拧成一个右旋的三螺旋组成的。这种结构的另一个特点是，三螺旋的紧密排列要求一级序列中的每三分之一残基为Gly，因为在三螺旋的内轴线上没有任何较大的氨基酸空间。因此，胶原蛋白的第二个特征是重复氨基酸序列模式（gly-xaa-yaa）n[1]。另一个特点是，非甘氨酸的位置经常被亚氨基酸脯氨酸占据。对于动物胶原蛋白，yaa位置的pro残基，约占所有残基的10%，通常被prolyl-4-羟化酶（p4h）翻译后修饰，得到4-羟脯氨酸（hyp）。这种修饰是非常重要的，特别是作为三螺旋良好热稳定性的内在要求，同时也有助于胶原纤维的自缔合，以及参与某些受体相互作用[2]。虽然胶原蛋白崽学术界被认为是一种物质，但在人体和其他哺乳动物中至少有28种基因的不同类型，它们都具有不同的结构特征。最丰富的胶原是形成胶原纤维的间质胶原，特别是I型胶原，存在于所有主要结缔组织中。I型胶原是一种易于获得和纯化的胶原，已成为生物医学和组织工程应用的主要胶原。利用重组技术生产胶原蛋白。重组技术不仅能够生产出具有统一产品质量的无病产品，还可以产生不常见的胶原类型，而这些稀有的胶原蛋白从组织中直接提取并不实际。重组技术通过引入突变残基、选择特定结构域制备出具有多个重复基序的工程产品和嵌合结构，也有机会对天然蛋白质结构进行修饰和改进。然而，重组技术的潜在缺点是，重组胶原也需要功能性p4h的共同表达，以增强三螺旋稳定性。而p4h酶由两种不同的链类型组成，每种链的分子质量约为65kda。如果胶原三螺旋的稳定性较低，则产品为变性胶原和明胶，明胶只有单链组成，无法折叠成天然的三螺旋结构。此外，虽然重组技术可以用于实验室样品的小规模生产，但对于商业规模的生产，仍然存在控制工艺和成本评估方面的问题。

此外，基于转基因生物的其他系统也相继出现。目前，利用转基因小鼠生产胶原蛋白。另一个适合于纤维蛋白的系统是在转基因家蚕的茧中生产重组人Ⅲ型前胶原。转基因植物中的胶原蛋白生产也得到了发展，似乎提供了成本效益高、商业化的结果。最初的报告从种子中的发酵物中产生未经羟基化或羟基化不良的胶原蛋白。在生产系统中引入p4h对于优质的胶原蛋白产品是必要的。最近，利用p4h也产生了异源三聚体胶原蛋白，这种方法具有可商业化的前景。重组系统可能还有更多的优点，但目前依然停留在实验室水平上。

重组细菌胶原：一个新兴系统

胶原蛋白被认为与多细胞动物组织有关。在最近的一段时间里，在其他物种中出现了类胶原分子的发现，在一些真菌、病毒和噬菌体中存在（gly-xaa-yaa）n重复序列。然而，最有趣的是，在细菌和正在出现的大量细菌基因组中发现了许多类胶原结构。在化脓性链球菌中发现了一个具有胶原样重复序列的基因，这是一种毒力因子。随后，从同一物种中鉴定出第二个结构独特的类胶原基因。生物化学和生物物理学研究表明两者都具有典型的胶原三螺旋结构。

令人惊讶的是，这些胶原蛋白在哺乳动物体温附近都是稳定的，融化温度分别为36.4℃和37.6℃，不存在任何羟脯氨酸。

细菌胶原序列可能是真核生物水平基因转移到细菌的结果。然而，无论基因起源如何，很明显，一系列的结构、功能和分子相互作用已经进化并建立起来。对病原菌的少数类胶原结构进行了深入研究，表明胶原基序通常与细菌的外膜有关，并可能与宿主相互作用，以协助入侵或帮助病原体逃避宿主免疫系统。例如，这种结合可以是与整合素受体或其他细胞外基质分子的结合，介导病原体被人类细胞内化。

开发细菌胶原蛋白作为一种新的医学材料的另一个好处是可以很容易地大量生产。毫无疑问，这部分是因为细菌胶原蛋白比人原纤维胶原蛋白序列短。据报道，使用高细胞密度策略和延长的24小时生产时间，化脓链球菌Scl2构建体的最高产量可达19 g / L。 该构建体包含N端非胶原结构域，但是这仍然给出了约14 g / L的胶原结构域计算产量。良好的发酵产量仍然需要与简单有效的下游纯化方案相匹配。 对于商业生产，实验室纯化方案（例如带有His6-tag的固定化金属亲和色谱法和其他较小规模的色谱系统）不适用。总之，缺乏细胞毒性和免疫原性，生产和纯化的容易性足以表明细菌胶原蛋白有望用于生物医学材料。然而，重组技术也提供了机会，使结构易于适应以赋予确定的功能或新功能。一些细菌胶原蛋白已经鉴定出内源性细胞结合域。“空白”是指可以用一个或多个定义的功能来设计和制造分子。通过改变现有的螺旋结构域或通过插入额外的三螺旋基序，各种团体已经对此进行了探索。基于仅在人类I型胶原蛋白中发现的大量生物学域，更不用说在胶原蛋白中增加其他功能的机会了，更不用说从众多其他胶原蛋白类型和相关的三螺旋蛋白中出现的生物学域了。另外，可以像其他蛋白质一样，将非三螺旋结合基序（例如RGD）重组（或在整个化学过程中）添加到CL结构域的N端或C端。相似的非三重螺旋序列添加还允许开发具有定义的特定生物学功能的其他新分子。最近，已证明向化脓性链球菌CL结构域的C末端添加丝状基序（GAGAGS）n能够与丝质底物结合，从而提供了开发更复杂的复合结构的机会。

生物技术的一个关键考虑因素是，可以从新的细菌胶原基材料中开发出什么产品？像哺乳动物的胶原蛋白一样，在生物医学产品中肯定会有机会，将新的胶原蛋白用作涂层或制成特定的设备，以提供用于特定用途的增强产品。例如，作为涂层，细菌胶原可以被生物工程化以引入离散的整联蛋白结合序列GLPGER，GFPGER或GFPGEN，以靶向特定的整联蛋白结构域（α1I结构域或α2I结构域）。这样提供的涂层基质可以区分内皮细胞和平滑肌细胞粘附，同时避免任何血小板凝集，而血小板凝集对于血管假体和其他心血管技术具有特殊的应用。如设计的生物活性水凝胶和其他形式（例如海绵）产生细菌胶原的能力进一步扩展了潜在的生物医学和组织工程应用。最近的研究表明，当使用适当的稳定和干燥存储策略时，也可以为此类产品获得足够的保质期。

总结与展望

除了重组技术和生物工程细菌胶原蛋白在生物医学和组织工程应用中的前景的当前实例外，未来还会出现其他中药的发展。但是内在稳定性的进一步增强是未来发展的重要突破点。这可能是由于发现了更稳定的分子（例如高稳定性，Tm = 42℃，在噬菌体胶原蛋白中发现了胶原蛋白）或通过对序列进行了修改而结合了对不同序列特征的现有理解而引起的，包括静电相互作用，可以增强稳定性。增加稳定性的另一种选择是添加Hyp，该产品目前未包含在大肠杆菌生产系统中。以前，已经提出可以通过向发酵培养基中加入修饰的氨基酸Hyp来实现，尽管掺入的效率可能受到限制并且对序列中的Yaa位置没有特异性。然而，最近，已经描述了在大肠杆菌中发酵期间允许胶原结构域的Yaa-位置特异性翻译后羟基化的系统，并且该系统对于短肽长度的胶原底物是有效的。这种方法对细菌胶原蛋白的使用可能会受到其较大尺寸和Xaa位置Pro比例较高的限制。 另一个潜在的发展领域是嵌合结构。 这些可能包括不同细菌胶原蛋白成分的复合结构，例如，使用不同物种的折叠结构和胶原蛋白结构域，或者使用不同胶原蛋白结构域，或者包含细菌胶原蛋白和不同蛋白质的构建体，例如丝绸，弹性蛋白 或其他胶原蛋白。还存在进一步使细菌胶原蛋白核心蛋白功能化的机会，以允许选择性地对一种或多种肽或非肽分子之一进行简单而复杂的束缚，以实现特定蛋白质材料的既定开发。

胶原蛋白在生物医学设备中已经确立了重要地位，在生物医学设备中，已经开发了包括制造的组织和可溶解的胶原蛋白格式在内的不同形式。这些产品已成功用于许多不同的临床应用中。 然而，在某些情况下，例如用制造的基于组织的硬脑膜替代物，已经观察到不幸的不良后果，在该示例中由于疾病传播导致死亡。该示例以及疾病传播带来的其他潜在问题，意味着仍然需要考虑使用基于天然胶原的材料和设备。 在商业重组生产人类胶原蛋白方面已取得显着进展。但是，已经在大肠杆菌中鉴定并产生重组非动物（细菌）胶原蛋白的快速兴起的技术引入了令人兴奋的新胶原蛋白选项，可以轻松地针对特定的生物医学应用对其进行定制。这些定制的胶原蛋白将为在医疗设备，可植入材料以及潜在地用作干细胞支架等更多样化的应用铺平道路，仅举几例这些重组细菌胶原蛋白的用途。为了实现商业化，需要在中试规模（例如500 L批量）下进行高发酵产量和直接纯化过程的未来演示，以显示可扩展性和评估过程的经济性。 中试规模的批次还将促进大量材料的生产，然后可将其用于一般动物模型中的更广泛的生物学评估和应用开发，然后再定义用于特定生物医学应用的功能性动物模型。