肝窦内皮细胞在非酒精性脂肪性肝病发病过程中的作用

杨 婧， 高 红， 赵耀伟， 王 锐

黑龙江中医药大学 基础医学院， 哈尔滨 150040

非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是指除酒精和其他明确的损肝因素外所致的肝细胞内脂肪过度沉积为主要特征的临床病理综合征，包括单纯性脂肪肝(NAFL)、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)及其相关肝硬化，表现为脂肪变性、肝细胞损伤、炎症和不同程度的纤维化。肝硬化由肝纤维化发展而来，是所有慢性肝损伤的严重病理阶段。肝纤维化和肝硬化涉及细胞外基质的过量产生，而细胞外基质与肝窦内皮细胞(liver sinusoidal endothelial cell,LSEC)密切相关。受损的LSEC可合成TGFβ和血小板衍生生长因子，激活肝星状细胞(HSC)，促进细胞外基质的合成[1]。随着肥胖的增加以及相关代谢综合征的出现，NAFLD如今已成为欧美等西方发达国家和我国富裕地区慢性肝病的重要病因，估计全球患病率为25%[2-3]。最近的一种建模方法估计，美国的NAFLD病例将从 2015年的8300万(相当于约25%的人口)扩大到2030 年的1亿，相当于超过33%的人口。 重要的是，患有代谢综合征和NASH的患者在没有肝硬化的情况下也会发展为肝细胞癌(HCC)[4]。

肝脏内皮细胞主要由LSEC组成，它们是存在于内脏脂肪组织和肠道血液之间的高度特化的内皮细胞。LSEC在人体中具有独特的表型， 因为它们缺乏基底膜并且具有组织成筛子的多个窗孔，其调节跨越窦状隙的大分子(包括脂质和脂蛋白)的转运。LSEC作为肝脏的重要生理结构，与NAFLD相关性的研究被提上日程，并逐渐成为研究热点，有望成为治疗NAFLD发展的突破点，为其提供强有力的生理依据。本综述将特别关注LSEC在NAFLD病理生理学中的作用。

1 LSEC概述

LSEC来源于骨髓造血祖细胞分化的内皮细胞，是肝非实质细胞的主要细胞群，具有高度专业化。由LSEC构成的肝窦壁是全身毛细血管壁唯一缺乏基膜的毛细血管，约占肝细胞的15%～20%，但仅占肝体积的3%[5]。窗孔是LSEC最具特征性的结构。它们有一个不连续的结构，这意味着腔质膜和无瘤质膜的融合发生在细胞连接的其他部位，这个区域称为“芬瑞斯特”。卢艳娴等[6]通过尾静脉注射脂多糖诱导小鼠急性肝损伤模型，检测血清中AST、ALT、NO的水平,比较肝组织中小窝蛋白-1的表达情况及LSEC窗孔的改变情况。发现丹参多糖能降低血清中AST、ALT、NO水平，减少小窝蛋白-1的表达，增加LSEC的数目，并使其窗孔孔径增大，进而达到保护肝脏的作用。

在生理条件下，LSEC是肝脏稳态的守门者，它通过阻止Kupffer细胞和HSC活化以及调节肝内血管阻力与门静脉压力来显示抗炎和抗纤维化特性。在病理条件下，LSEC在慢性肝病的发生发展中起着关键作用。 在NASH阶段，改变的LSEC释放炎症介质并促进炎症细胞的募集，从而促进肝损伤和炎症。改变的LSEC也不能维持HSC静止并释放纤维化介质，包括Hedgehog信号分子，促进肝纤维化。肝脏血管生成在NAFLD中增加并且有助于肝脏炎症和纤维化，也有助于HCC的发展。成熟的LSEC在正常情况下可以自行增殖，当LSEC祖细胞占正常啮齿动物肝脏LSEC的1%～7%时，可能对LSEC的再生有贡献[7]。骨髓来源的LSEC祖细胞不参与正常肝脏的LSEC转换,相比之下，肝损伤后，这些细胞是肝再生的主要驱动力。

血管内皮代表血液和其他组织之间的界面，不仅是一个物理屏障，而且参与了不同的生理和病理过程，包括止血、血栓形成、代谢物的运输、炎症、血管生成和血管张力 。谭朝辉等[8]将雄性 Wistar大鼠随机分为正常组、模型组、逍遥散组和氟西汀组并诱导大鼠抑郁样行为，发现逍遥散可显著增加大鼠糖水消耗、爬格数和直立数，显著降低血清 TNFα、 IL-6 水平， 增加窗孔数量与大小，改善肝窦内皮血管化倾向。 研究表明逍遥散可显著改善大鼠抑郁样行为，可能与其降低炎症因子、改善肝窦内皮功能作用有关。

肝窦有双重血供，接受门静脉血流(70%)和肝动脉血流(30%)[9]。血压在窦内平衡，然后将血液排入肝静脉和下腔静脉。尽管消化导致肝脏血流量发生了重大的昼夜变化，但健康人的肝静脉压力梯度仍保持在4 mm Hg或以下，证明肝血管张力有很好的调节作用[10]。肝内剪切应力被认为是肝血流调节的主要驱动因素[11]。

在正常条件下，就像其他血管床一样，内皮细胞在肝脏中能够产生血管舒张剂，以应对增加的剪切应力，从而减缓血压的升高，这种特性的丧失称为内皮功能障碍。内皮功能障碍发生在慢性肝病的早期，甚至在纤维化和炎症发生之前，并在晚期肝硬化中持续存在。长时间剪切应力诱导的内皮细胞特异性转录因子——Kruppel样转录因子2介导剪切应力的这种作用[12]。Kruppel样转录因子2可诱导包括NO在内的血管扩张剂的内皮增生[13]。经研究[14]证明，LSEC是正常肝脏中NO的主要来源，通过剪切应力激活内皮型一氧化氮合酶(eNOS)。

2 LSEC与NAFLD的相关性

2.1 LSEC的特异性

2.1.1 肝窦毛细血管化 LSEC的毛细血管化，也称为去分化，发生在动物模型和患者肝脏损伤后[15-17]。在肝窦毛细血管化形成初期，吞噬细胞可在外界病理刺激因素作用下活化，并转移至肝血窦，在吞噬细胞的浸润下，肝血窦逐渐变窄,甚至堵塞。同时，吞噬细胞会导致内皮细胞窗孔数量减少及孔径减小，从而加速肝窦毛细血管化的进展[18]。肝窦毛细血管化时，肝血窦内一些细胞及细胞外间质成分将发生一系列改变。有学者[19-20]指出,HSC活化与肝窦毛细血管化的形成密切相关。毛细血管化是一个早期事件，因为它先于HSC和Kupffer细胞的激活与肝纤维化的发生，提示毛细血管化可能是纤维化发生的一个必要的初步步骤[16,21-22]。简而言之，LSEC只要分化就能保持HSC的静止状态，从而使分化的LSEC成为纤维化的守护者[23-24]。事实上，在实验模型中，体内LSEC分化的恢复促进了轻度纤维化的消退[23,25]。然而，尽管肝硬化消退，窦状毛细血管仍然存在。因此，在这种情况下，LSEC的分化并不是纤维化消退的关键[26]。研究[27-28]表明，肝窦毛细血管化可导致肝脏组织供血动脉化，从而导致肝硬化的形成以及后续的肝癌发生。

谢知兵等[29]通过扶正化瘀方药物粉末以0.46 g/kg大鼠体质量的剂量配制成悬液，给予三组SD大鼠灌胃，观察不同条件下体外传代的LSEC vWF和CD31的蛋白表达情况，发现扶正化瘀方可抑制LSEC vWF和CD31的表达，增加细胞表面的窗孔结构，具有潜在的逆转肝窦毛细血管化的作用。

2.1.2 肝血管再生 血管生成的定义是从原有血管中发展出新的血管。肝血管生成发生在肝纤维化过程中，这两个过程密切相关。肝纤维化促进血管生成，而肝血管生成又加重肝纤维化。鲁军等[30]通过分离正常大鼠 HSC、LSEC和肝纤维化模型大鼠 LSEC，利用慢病毒转染得到血管内皮生长因子 (VEGF) 过表达 HSC。研究表明疏肝健脾活血方可能通过下调VEGF蛋白表达，进而抑制VEGF信号通路，恢复 LSEC窗孔结构，从而逆转肝窦毛细血管化。此外，LSEC还通过释放血管分泌信号来平衡肝脏再生和调节纤维化。

2.1.3 炎症和感染 LSEC通过两种方式调节肝脏炎症。首先，LSEC是将血液从肝脏中分离出来的屏障，因此限制或允许循环白细胞进入肝脏组织。LSEC表达细胞间黏附分子-1和血管黏附蛋白-1，使白细胞与内皮细胞黏附。炎症过程中，细胞间黏附分子-1、血管细胞黏附分子-1和CD31的表达增加，导致白细胞的跨内皮迁移。第二，LSEC对淋巴细胞行为有调节作用。在生理条件下，LSEC抗原递呈可诱导CD8细胞耐受[31]。LSEC还能诱导T淋巴细胞分化为免疫抑制调节性T淋巴细胞，在体外和体内均具有功能[32]。在炎症条件下，LSEC也具有抗炎作用，因为它们通过Notch途径增加辅助性T淋巴细胞1中抗炎细胞因子IL-10的表达[33]。

此外，LSEC是病原体攻击的靶点。由于其具有的清除能力，LSEC可以通过表面凝集素的表达而捕获循环病毒，进而使肝细胞受到感染，如HBV和HCV[34-35]所观察到的那样。同时，LSEC也可以被细菌感染，如研究[36]显示，LSEC中的Bartonella杆菌与血管瘤病和脂溢性肝炎有关。

总之，LSEC具有独特的高渗透性表型，允许某些分子和细胞传代，但不是所有的分子和细胞。它们通过毛细血管化、血管再生及炎症和感染等多种致病因素，参与了NAFLD相关疾病的发生和发展。以上LSEC所表现出来的特异性可能会限制与全身给药相关的副作用，同时为相关肝病的治疗带来新的希望。

2.2 LSEC在NAFLD中的作用

2.2.1 LSEC与NAFL LSEC在正常肝脏脂质转移中发挥着作用，而存在于循环中的膳食脂质必须通过血管内皮转运才能被组织所代谢。在生理条件下，LSEC是血液和肝实质之间双向脂质交换的主要调节剂。

LSEC毛细血管化在NAFL中发生并促进肝脏脂肪变性，伴随着形态和功能的变化。最显著的表型变化之一是窗孔的损失，也称为脱壳或血窦毛细血管化，与在LSEC的近腔表面上形成基底膜有关。

血窦毛细血管化的触发因素尚未完全确定，但过量的膳食常量营养素，包括脂类、碳水化合物和肠道微生物群衍生产品，都会发挥作用。无菌小鼠菌群移植实验[37]证实，肠道菌群与NAFLD存在因果关系。Cogger等[38]发现不同饮食喂养的小鼠会表现出不同的常量营养素和能量含量，并表明LSEC窗孔(频率、孔隙度和直径)与循环游离脂肪酸(FFA)水平之间存在负相关, 同时其在过量脂质暴露后会发生脱落的现象。

2.2.2 NASH中的LSEC LSEC有助于NASH的氧化应激，在脂毒性反应中，肝细胞产生活性氧并引发强烈的炎症反应，加剧肝损伤[39]。 实际上，活性氧不仅在肝细胞中检测到，而且在NASH患者的窦状细胞中也被检测到[40]。因此，在NASH中，活性氧产生不仅发生在肝细胞中，而且在一定程度上发生在 LSEC中，并且似乎有助于肝细胞损伤。

LSEC在NASH初始阶段的抗炎作用由简单的脂肪变性进展为脂肪性肝炎，伴随着白细胞与窦内皮的黏附，随后白细胞浸润在肝实质内形成炎性病灶[41]。中度和消退的炎症反应对肝脏有益，因为它们促进体内平衡的重建， 促进组织修复并发挥肝脏保护作用[42]。 然而， 如在NASH中所见，慢性炎症导致肝细胞死亡并导致肝实质损伤[43]。在生理条件下，LSEC构成调节肝实质内循环白细胞进入的屏障，并发挥抗炎作用[32,44]。在NAFLD进展的早期阶段，一些证据[45-46]表明LSEC也表现出抗炎功能。事实上， Tateya等[46]证明了来自LSEC的NO在短时间(8周)喂食高脂肪饮食的小鼠中抑制 Kupffer细胞活化。在体外，短时间(16 h)暴露于FFA的人和鼠LSEC均可表现出下调的促炎性趋化因子，并通过MAPK依赖途径参与单核细胞和巨噬细胞募集[45]。脂肪变性过程中脂质过多可导致LSEC功能障碍。体外实验[47]表明，用氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)刺激人原代LSEC，它会通过ox-LDL受体即凝集素样氧化低密度脂蛋白受体1(LOX1)下调eNOS的表达。

LSEC在NASH的晚期阶段促进肝脏炎症，但LSEC的改变发生在NAFLD进展的早期阶段。实际上，LSEC毛细血管化先于 Kupffer细胞活化而出现，同时，LSEC毛细血管化和功能障碍也会促进肝脏炎症。在NALFD进展期间，LSEC最终会表现为促炎表型和功能障碍的转化。

2.2.3 LSEC与NASH相关的脂肪性肝纤维化 肝纤维化定义为肝实质中细胞外基质的过度沉积，导致肝纤维化的主要机制是肝细胞损伤和炎症引起的并且由HSC活化介导的长期伤口愈合过程。HSC的激活与增殖是肝纤维化发生的中心环节[48]，同时，HSC是接近LSEC的非实质细胞，它在Disse腔中可储存视黄醇，并且在肝损伤和炎症反应期间将其表型转变为活化的肌纤维母细胞状态，分泌大量细胞外基质化合物。如上所述，LSEC是NASH中肝脏炎症的主要效应物，因此也促进肝纤维化。

在NASH中，膨胀的肝细胞产生Hedgehog分子，因此很有可能在NASH期间，Hedgehog 配体被肝细胞和LSEC释放，从而通过自分泌和旁分泌作用激活LSEC本身以及静止的HSC。继而活化的HSC分泌Hedgehog分子，促进LSEC毛细血管化，这反过来有利于HSC活化，促进纤维化过程。夏雪皎等[49]通过采用CCl4腹腔注射建立肝纤维化大鼠模型后分离LSEC，同时收集正常大鼠HSC和 LSEC以作对比。研究发现，健康的LSEC可以维持HSC的静止状态，但毛细血管化的 LSEC失去了这种能力，然后在肝纤维化发展的过程中出现毛细血管化和HSC活化之间的恶性循环。

在NAFLD过程中，LSEC功能障碍可以促进肝纤维化内皮功能障碍，并且在NASH动物模型中出现纤维化。表明肝窦内皮功能障碍导致肝纤维化。赵士峰等[50]提出川芎嗪可能通过改善病理性血管生成发挥抗肝纤维化作用的假说，并用腹腔注射CCl4的方法建立大鼠肝纤维化模型，预防给予川芎嗪(100 mg/kg)处理和应用VEGF-A构建原代小鼠LSEC促血管生成模型。该研究表明，川芎嗪能够通过抑制病理性血管生成从而改善化学诱导的肝纤维化，同时，研究明确了川芎嗪抑制肝纤维化过程中肝窦血管生成的分子机制，为靶向Hedgehog通路的抗肝纤维化新药研发提供理论与实验依据。

2.2.4 LSEC在NASH诱导的HCC中的作用 在大多数情况下，HCC在慢性肝病的背景下发展而来(占所有患者的70%～90%)。患有代谢综合征和NAFLD的患者在没有潜在的肝硬化情况下也会发生HCC，这表明NAFLD具有特异性的致癌途径[51]。

发育不良结节优先通过门静脉接受血液供应，类似于肝硬化再生结节，随后，血管生成会导致一个高度血管化的结节甚至肿瘤，并促进肿瘤的发生发展和转移。在NAFLD中，血管生成受到高度刺激并促进NAFLD相关的HCC，因为各种血管生成抑制剂都可以预防HCC的发展。

在肝癌进展中，内皮细胞逐渐失去稳定素-1、稳定素-2、Lyve-1和CD32b等，小鼠肝癌模型和人肝癌模型中均有观察到类似现象[52]。此外，与健康人的肝LSEC相比，人肝癌内皮细胞具有较高的整合素表达，低表达细胞间黏附分子-1，并表现出更高的血管生成、促凝和纤溶能力，进而表明肝癌与肿瘤内部和周围内皮细胞的变化有关。

3 总结与展望

即使对于LSEC在NAFLD中作用的研究已经在过去几年中取得了进展，但仍存在一些问题。首先，导致NAFLD中LSEC发生改变的首发因素大多是未知的，需要进一步的探讨和研究。 其次，需要确定NAFLD内皮变化的机制，包括毛细血管化，这可能为NAFLD提供新的治疗靶点。第三，LSEC在NASH相关性肝硬化中的作用尚未得到具体验证。LSEC功能和表型是否与其他原因相关的肝硬化有关仍有待评估。第四，虽然NAFLD被公认为有利于HCC的发展，但仍处于了解LSEC变化如何有利于HCC发展的早期阶段。

LSEC作为生理条件下肝脏稳态的守门者。在早期的NAFLD进展中，表现出毛细血管化以及内皮功能障碍，即单纯性脂肪变性阶段。由脂毒性、脂肪因子、炎症和肠道微生物群衍生的产物可引发LSEC的变化和能力丧失，进而导致NASH甚至相关肝纤维化的发生和发展。在NASH阶段，改变的LSEC有助于肝脏血管生成、炎症、纤维化和HCC。综上，改善LSEC的状况对治疗NAFLD具有很大的潜力。当前的挑战是确定专门针对LSEC以调节其活动的相应策略，从而达到治疗NAFLD的理想效果。

作者贡献声明：杨婧负责课题设计，资料分析，撰写论文；高红、赵耀伟等参与收集数据，修改论文；王锐负责拟定写作思路，指导撰写文章并最后定稿。