色氨酸合成酶基因工程菌的研究

于巧玲，徐礼生，张兴桃，李婷婷，叶 静，孙，于 婷

（宿州学院生物与食品工程学院，安徽宿州 234000）

0 引言

哺乳动物体内不存在色氨酸合成途径，人和动物必须从外界获取生长所需要的色氨酸，而色氨酸合成酶能够高效催化吲哚与L-丝氨酸反应，合成L-色氨酸。因此，色氨酸合成酶发挥着至关重要的作用，直接影响着色氨酸的产量。色氨酸作为第二必需氨基酸，参与调解人和动物的生长发育，缺乏色氨酸将会降低人体消化功能和体液免疫功能。而对于结核杆菌，色氨酸营养缺陷型菌株很难在巨噬细胞中繁殖，甚至不能存活。因此，色氨酸被广泛应用于医药、食品和饲料添加等领域，色氨酸的功效使得色氨酸合成酶成为研究结核药物的核心目标。20世纪50年代，固定化技术受到关注和研究，随后高速发展，研究者把酶固定成球体，显著改善了游离菌存在的不足。近年来，随着对固定化技术更深层次的研究，酶的机械韧度和稳定度得到了提高。从色氨酸合成酶的性质、作用机理、酶固定化及应用等4个方面进行分析，以期为色氨酸合成酶工业化应用提供一定理论基础。

1 色氨酸合成酶的性质

色氨酸合成酶（TSase） 基因总长807 bp，可编码269个氨基酸[1]。色氨酸合成酶呈现出α2β2亚基结构，其中α和β亚基能够独立编码，单独催化反应，也可以相互激活调节催化反应能力[2]。吲哚在α亚基活性部位产生，在β亚基活性中心发生反应，两亚基间的特殊通道作为“桥梁”协助反应进行[3]，因此色氨酸合成酶成为探索小分子的移动运送通道、分子运送中的能量转移路径和活性部位间的相互作用、信号传递通道以亚基间互相影响的典范[4]。利用生物技术，克隆色氨酸合成酶基因trpBA，构建表达载体pET-trpBA，色氨酸产量达9.8 mg/L，提高了4.9倍[5]。采用 PCR扩增抗反馈抑制的serA和trpBA基因，将2个基因以多种方式串联在pET22 b（+）上，在各自启动子作用下，2种蛋白酶共表达，检测并筛选出TSase和PGDH酶活性较高的菌株ABA-I，摇床发酵发现，该菌株色氨酸产量增加了20.2倍[6]。采用双菌酶法，将来自不同菌的2种酶结合，利用酶的优势互补，共同催化吲哚和DL-丝氨酸，提高底物转化率。另外，利用色氨酸合成酶高产菌株，间歇式添加吲哚，同样能够达到高产色氨酸的目的。克隆、表达和纯化色氨酸合成酶α，β亚基蛋白，研究重组蛋白的酶学特性，结果表明色氨酸合成酶β反应最佳温度为37℃，大于40℃时，酶活显著降低，80℃的酶活只有10℃时的10%；最适pH值7.5，最佳Na+浓度为0.15 mol/L，最佳Mg2+浓度为0.18 mol/L；当TRPSA/TRPSB的浓度比为1.411时，即摩尔比为2.2时，酶活最大[7]。

2 色氨酸合成酶的作用机理

研究显示，吲哚在α活性部位产生后，经过2个亚基间的特殊通道进入β亚基活性中心与L-丝氨酸发生PLP依赖性反应，在β亚基活性中心生成L-色氨酸[8]。晶体结构显示αββα亚基结构中2个亚基活性中心相距25Á，α，β反应是相互促进调节的。α亚基中，Glu-49和Asp-60是主要的活性位点残基；Lys87和PLP结合构成连体，在β亚基中催化反应。吲哚是一种中等疏水性物质，很容易从没有引流通道的细胞中流失。在Salmonella typhimurium TSase中，2个亚基间形成显著的疏水通道，β亚基反应可抑制开放相位和闭合相位的转化[7]，有效防止吲哚损失，确保催化反应的高效性。色氨酸合成酶催化indole-3-GP，形成靛蓝的起始原料[9]，细胞色素P450单加氧酶（CYP） 催化吲哚生成吲哚酚[10]，吲哚酚在GL催化下生成靛蓝的前体物质[11]，并最终合成靛蓝类色素物质。

3 色氨酸合成酶固定化

固定化是一项重要的革新技术，酶的固定化是在蛋白质固定化的发展下演变而来。可通过吸附、离子交换、交联、包埋、共价连接物等方法将酶固定在特定载体或区域上[12]。相对于游离的单细胞而言，固定化酶在保持原有催化活力的同时，还具有产率高、应用范围广等优点。将酶固定成球体，不仅增加了酶分子结构稳定性，提高细胞对底物和产物的耐受性，还有利于产物分离，有效控制生产过程。海藻酸钠具备良好的稳定性和较高的强度，是包埋游离菌的良好材料。然而，需要改进由海藻酸钠和戊二醛包埋制备的固定化细胞的吸附性和机械强度。因此，当合成L-2-甲基色氨酸时，采用改性玉米秸秆纤维作为填料来制备固定化色氨酸合成酶基因工程菌[13]，有效改善了包埋法存在的不足。

4 色氨酸合成酶的应用

克隆表达色氨酸合成酶α亚基基因，扩增trpA基因，构建重组质粒，大肠埃希菌DH5α作为宿主菌体，表达并纯化色氨酸合成酶α亚基[4]，其功能研究为色氨酸合成酶的药物挑选提供了参考依据。优化密码子，采用单因素和响应面法研究最佳反应条件，以甲硫醇和L-丝氨酸为反应原料，制备S-甲基-L-半胱氨酸，从而为S-甲基-L-半胱氨酸的制备提供新方法[14]。构建H37 vTRPSA和TRPSB氨基酸序列进化树，分析色氨酸合成酶α，β亚基之间的进化关系，结果表明，TRPSA，TRPSB在分枝杆菌中是特异的、保守的。因此，H37 vTRPSA和TRPSB可以作为药靶用于设计针对分枝杆菌的新型药物[7]。针对增强色氨酸合成酶活性、提高底物的溶解度和反应效率，以甲苯为有机相，在最佳反应条件下催化合成2-甲基-L-色氨酸时，色氨酸合成酶具有最高的相对酶活性[15]。使用生物信息学方法分析和功能预测DMATS（二甲烯丙基色氨酸合成酶）蛋白质序列，发现该基因家族的保守motif是设计编码内生真菌DMATS基因的RNA干扰引物的切入点，抑制该基因表达，影响合成碱的能力，从而使醉马草“脱毒”成为“益草”[16]。目前，色氨酸合成酶反馈抑制位点的残基尚无定论，将trpAB的活性位点与Thermus thermophiles TRPSB螯合PLP的模板进行比较，找出PLP周围适宜范围内的氨基酸残基，利用定点突变，对具有最突出空间位置和作用力的位点进行诱变，表达纯化测定酶活，找到可能的活性中心位点 Ser390，Ser99，Gln128，Ser249，Asn250，Glu364，Thr204，His100，发现突变后酶活下降明显，因此鉴定这些位点对催化反应有十分重要的作用。

5 结语

酶的固定化和基因工程技术的应用极大地推动了生产色氨酸的工业化进程，基因工程菌的构建显著提高了生产菌株的底物转化能力。产量高、操作简单、易于自动化生产等优点使得基因工程菌的氨基酸生产水平逐渐满足市场需求。同时，低污染、低成本的优越生产方式深受研究者的青睐。作为基因工程菌，色氨酸合成酶高效的催化吲哚与丝氨酸反应，合成L-色氨酸，使色氨酸在医疗保健、食品生产等方面发挥作用。通过吸附、离子交换、交联、包埋、共价连接物等方法制备固定化酶，在保持酶活力的同时，有效控制生产过程，简化生产工艺。近年来，定向进化技术飞速发展，未来色氨酸合成酶的应用前景将会更加广阔。