保健食品中非法添加物检测的前处理及分析方法研究进展

火 婷，胡 玥，高旭东，李云春，魏小宁，邵士俊

(1.中国科学院 兰州化学物理研究所 中科院西北特色植物资源化学重点实验室，甘肃 兰州 730000; 2.中国科学院 兰州化学物理研究所 公共技术服务中心，甘肃 兰州 730000)

近年来，随着大众健康保健意识日益增强，对保健食品的需求也与日俱增.保健食品又称功能性食品，是一个特定的食品种类，保健食品被定义为：具有一般食品的共性，能调节人体的机能，适用于特定人群食用，但不以治疗疾病为目的[1-4].然而，面对高额利润的诱惑，同时为了实现前期的宣传功效，不法商贩常在保健食品中非法添加具有治疗效果的药物[5-6]和有害成分，且添加成分也日趋复杂，这些现象都对保健食品的食用安全造成了严重威胁.二氢吡啶类钙拮抗剂药物在临床中适用于治疗各型高血压尤其是重症高血压，但由于其价格便宜，成为最常见的非法添加药物之一，被非法添加在降压类保健产品中[7].西地那非、他达那非等药物被非法加入抗疲劳保健食品中.马来酸氯苯那敏等抗组胺类化学药物被非法添加至保健食品的制剂中[8]，导致消费者产生药物过敏.此外，还有比较常见的饮片染色[9]、非法添加物的来源不明[10-13]、剂量随意[14]、排异性未知[15]等现象.若长期服用含有非法添加物的保健食品，会极大损害消费者的身心健康和经济利益.为打击非法添加现象，规范市场秩序，国家食品药品监督管理局在2009年颁布了药品补充检验标准[16]，并且颁布了保健食品的食品安全国家标准[1].

由于保健食品的基质复杂、基体干扰严重，因此对于保健食品中微量甚至痕量非法添加物的分析而言，高效、高选择性的样品前处理方法和灵敏的分析手段至关重要.检测方法的局限性导致了监管困难，因此迫切需要建立多指标、全方位的检测方法，包括通过色谱技术实现目标化合物的分离，质谱技术进行定性确认，表面增强拉曼光谱或核磁共振波谱等技术实现辅助表征，为保健食品的质量安全提供技术保障.本文通过综述保健食品中非法添加物的各种传统及新型检测前处理和分析方法的研究现状，为进一步研究建立高效简便的前处理方法和检测新方法、新技术提供理论参考.

1 保健食品中非法添加物的样品前处理方法

前处理主要是指将样品通过分解和溶解方法实现对待测组分的提取、纯化、浓缩的过程，待测组分通过此过程转化为可直接进行测定的形式，最终完成待测组分的定性和定量分析检测.样品前处理方法的简单高效不仅可以实现检测省时省力，还可以有效避免人员操作和样品转移过程中引入的误差，并且减少有机试剂的使用.目前，保健食品中非法添加物常见的样品前处理方法主要包括溶剂萃取和固相萃取(solid phase extraction, SPE)等方法.

1.1 溶剂萃取法

最常见的样品前处理方法为溶剂萃取法.在对保健食品中非法添加物的前处理方法中，一般使用无机溶剂(水、酸、碱)或/和有机溶剂(甲醇、乙醇、二氯甲烷和混合醇等)萃取.康宁[17]等使用甲醇超声提取样品中5种非法添加物(青藤碱、罗通定、扎来普隆、文拉法辛、褪黑素)，选用合适的洗脱液(20 mmol/L乙酸铵+0.1%甲酸/甲醇)进行梯度洗脱，通过飞行时间质谱仪(time of flight mass spectrometry, TOF-MS)，采用电喷雾阳离子电离方式(ESI+)，通过多离子检测模式(multiple reaction monitoring, MRM)进行定量.刘斌等[18]将样品加入甲醇中超声提取，去离子水稀释后用超高效液相色谱-四极杆/静电场轨道阱质谱法(ultra performance liquid chromatography quadrupole/electrostatic field orbitrap high resolution mass spectrometry, UPLC-Q-Orbitrap HRMS)测定.

此外，随着研究的不断深入，也出现了很多新型溶剂萃取方法，比如Cao等[19]首次通过“点击”反应制备新型离子液体功能化聚丙烯腈纳米纤维毡(IL/PAN-NFsM)，并评价了其灵敏度，建立了高通量筛选方法.制备过程中首先采用静电纺丝法制备PAN-NFsM，它是一种纳米尺度下纤维众多的大尺度多孔材料，再通过硫醇-烯键反应得到SH/PAN-NFsM，随后甲基咪唑盐酸盐通过“点击”反应产生IL/PAN-NFsM.由于IL/PAN-NFsM良好的预分离效率，可以通过固相萃取过程在数十秒内从复杂的样品基体中吸附痕量目标物，然后作为直接分析实时质谱(DART-MS)的采样模块，无需任何额外的处理.这意味着集中在IL/PAN-NFsM上的目标分析物被直接解吸、电离，并用DART-MS进行最终检测.

1.2 固相萃取法(SPE)

SPE利用分离过程中的选择性吸附与选择性洗脱，最常用的方法是先使样品溶液通过吸附剂，由于吸附剂具有选择性，使待测组分保留在吸附剂上，适当比例的溶剂除杂后，通过筛选出的最佳洗脱剂将待测组分洗脱后待测，从而达到快速分离净化与浓缩的目的.谭丽容等[20]在将样品预处理除杂后，选用C18固相萃取柱除去糖类等极性物质，而后通过季胺固相萃取柱(SAX)，吸附和获得带有弱阴离子的化合物，最后经过羧酸固相萃取柱(WCX)，吸附和获得碱性的化合物.梯度洗脱过程中选用合适的流动相(0.1%甲酸和0.1%甲酸-乙腈)，合并SAX和WCX小柱纯化得到的洗脱液待测.采用电喷雾阳离子电离方式(ESI+)，通过MRM检测.通过SPE联用法对复杂样品进行分离纯化，降低基质成分对测定的干扰，提高检测的灵敏度.此方法大大降低溶剂用量，操作过程简单，检测结果准确，可用于改善阳虚和/或缓解疲劳类保健食品中非法添加物的检测，同时也为相应的监管机构提供技术支持.

2 保健食品中非法添加物的分析方法

目前保健食品中非法添加物的检测技术已取得很大进展，依靠于高效液相色谱及液质联用等技术，添加物的检出限和定量限均能满足相关机构的检测要求，常见的分析检测方法包括高效液相色谱方法(high performance liquid chromatography, HPLC)和超高效液相色谱方法(ultra performance liquid chromatography, UPLC).与普通的HPLC相比，UPLC具有灵敏度更高、分析速度更快和分辨率更强的优点.将UPLC与不同检测器串联，其中串联质谱的选择性及灵敏度明显优于串联其它检测器，也是现有分析检测技术中效果较好的一种.而最为常见的联用技术则包括高效液相色谱-质谱串联技术(HPLC-MS)、固相萃取-超高效液相色谱-三重四极杆串联质谱法(solid phase extraction-ultra performance liquid chromatography-triple quadrupole tandem mass spectrometry, SPE-UPLC-MS/MS)、UPLC-Q-Orbitrap HRMS以及新型的常温常压离子化技术实时直接分析质谱(direct analysis in real time，DART-MS)、离子迁移谱(ion mobility spectrometry，IMS)，另外还有表面增强拉曼光谱技术(surface-enhanced raman spectroscopy , SERS)、溶剂微萃取技术结合表面增强拉曼光谱法(SME-SERS)和核磁共振波谱技术(nuclear magnetic resonance spectroscopy, NMR)等.

2.1 高效液相色谱技术(HPLC)

HPLC具有灵敏度高、可反复使用色谱柱和样品易回收等特点.该技术在化学、医学、工业和法检等领域中应用广泛，其最重要的一步为待测物在色谱中实现分离.Wang等[21]采用高效液相色谱多维指纹图谱分析方法，建立了海狗人参丸中非法掺杂物的分级检测方法，通过HPLC(二极管阵列检测器和荧光检测器)分析11批样本获得指纹图谱，分析了Ⅴ型磷酸二酯酶抑制剂、雄激素、α受体拮抗剂和育亨宾等非法添加物，为减少和消除干扰同时突出样本的色谱特征，在多个波长下进行分析.通过标准指纹图谱与样品的色谱图谱对比，目标分析物易于识别，利用一阶、二阶指纹图谱和光谱检测相结合的方法，通过建立分层筛选策略，构建多维指纹图谱，利用该筛选方法避免假阳性和假阴性结果，得到了具有较高准确性和可靠性的试验结果.该方法已成功应用于实际样品中非法掺假物质的筛选，并通过验证试验，显示出良好的定量性能.在16批样品中，有3个疑似样品被确认为阳性，分别含有9.37 μg/g 睾酮、18.8 μg/g 他达那非和48.5 μg/g 西地那非.回收率为83.6%～103.1%，相对标准偏差为4.2%～6.8%.该方法简单易操作，且与HPLC-MS相比成本较低，在检出限以内可作为一种检测的替代方法.但是HPLC法只能通过保留时间定性，不能确证化合物结构信息[22].因此，HPLC常用于保健食品中微量非法添加物的分析检测.

2.2 超高效液相色谱法(UPLC)

与普通HPLC相比，具有1.7 μm填料的UPLC的灵敏度更高、分析速度更快、分辨率也更强[23].韩春晓等[24]采用UPLC技术实现了5 min内快速检测维生素C中非法添加地塞米松磷酸钠，检出限为10.0 mg/L.Huang F等[25]通过UPLC技术检测了胶囊、片剂、酒、咖啡、糖果等300多个保健样品中的17种壮阳类化合物，检出频率最高的为西地那非和他达那非，羟基硫代豪莫西地那非、去甲西地那非、硫代豪莫西地那非等成分检出频率较低.检出药物的添加量在保健酒和咖啡中分别为0.01%～0.05%和0.1%～1.0%，片剂及胶囊中的添加量为0.2%～20%.因此，UPLC常用于保健食品中痕量非法添加物的分析检测.

2.3 高效液相色谱-质谱串联技术(HPLC-MS)

HPLC-MS有效结合了液相色谱的分离性能和质谱的鉴定组分性能，实现了对复杂有机混合物的准确分离分析.HPLC-MS技术中电喷雾电离质谱的质谱图简单明了且数据处理简单，该技术广泛应用于有机分析、药物分析、食品检验以及生产质量控制和质检等方面.康宁[17]等通过HPLC-Q-TOF/MS检测出了安神类保健食品中的5种非法添加物(青藤碱、罗通定、扎来普隆、文拉法辛、褪黑素).该分析方法具有选择性强、灵敏度高、测试时间短、操作过程简单等优点.检测结果表明：5种非法添加物的质量浓度在10～1 000 μg/L时，线性关系良好，采用该方法对6种市售保健食品(胶囊、茶、口服液)进行检测，在其中一种胶囊中检测出质量分数为1.656 mg/kg的非法添加物青藤碱.HPLC-MS具有高灵敏度和高选择性，是目前非法添加化合药物检测中使用广泛的技术手段之一，但是高分辨质谱如TOF-MS因价格昂贵，不易推广[22].

2.4 固相萃取-超高效液相色谱串联三重四极杆质谱法(SPE-UPLC-MS/MS)

谭丽容等[20]建立了SPE-UPLC-MS/MS同时测定保健品中20种改善阳虚和/或缓解疲劳类化学物质的分析方法.其中盐酸育亨宾和二乙氨基前他达拉非的检测文献报道较少，以期完善非法添加壮阳类药物的检测种类，并为进一步规范保健食品市场提供技术支撑.通过进一步优化和选择试验条件，确定了固相萃取、色谱、质谱串联技术中各最佳条件，实现了5 min内完全分离鉴定20 种非法添加物.串联技术中通过固相萃取可实现对复杂样品的纯化，从而有效避免食品基质成分对测定的干扰，使检测灵敏度提高.20种改善阳虚或缓解疲劳类化合物在0.5～30 μg/L浓度范围内呈良好的线性关系，20种对照品的最低检出限(limits of detection, LOD)均低于0.2 ng/mL，定量限(limits of quantitation, LOQ)在0.1～0.5 ng/mL 范围.该方法操作简单、灵敏度高、重复性好，溶剂用量少，可用于改善阳虚和/或缓解疲劳类保健食品中非法添加物的检测，同时也为相应的监管机构提供技术支持.

2.5 超高效液相色谱-四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱法(UPLC-Q-Orbitrap HRMS)

UPLC-Q-Orbitrap HRMS是四极杆质谱和静电场轨道阱高分辨质谱串联并与液相色谱联用的检测方法,在具有普通液质检测方法定性功能的同时兼具质量分辨率高和筛查过程简单的优势，数据扫描模式(dd-MS2)可以在筛查的同时，通过碎片离子进行定性确认，弥补了传统低分辨质谱在筛查和定性上的不足[26-28].刘斌等[18]通过UPLC-Q-Orbitrap HRMS方法快速定量检测保健品中常见的29种非法添加物.选用高粒径的HSS T3(1.8 μm)色谱柱进行分离，以缩短扫描时间，每个样品只需15.5 min，同时实现了快速筛查和准确定量检测分析.质谱分析通过全扫描/二级扫描模式，建立一级质谱(MS)和二级质谱(MSMS)数据库实现高通量筛查及定量分析.各组分中线性良好的质量浓度范围为0.1～500 ng/mL，检出限为0.3～20 ng/g，回收率达68.2%～105.3%，相对标准偏差为0.4%～11.3%，对建立的方法进行方法学考察，能够满足日常检测的要求.

2.6 直接分析实时质谱(DART-MS)

新型常温常压离子化技术是近几年质谱学领域的一个研究热点，其中实时直接分析(DART)近年来已被应用于不同样品的分析.DART过程具有样品制备极其简单和检测流程简单的优点.大大提高了质谱仪器的易用性[29].Cao等[19]通过直接分析实时质谱(DART-MS)进行检测，将IL/PAN-NFsM固定在商用玻璃毛细管尖端的底部，用DART-MS进行自动直接分析.在最佳条件下，通过考察灵敏度和稳定性，对该方法的分析性能进行了评价，验证了该方法的可行性，在6种抗糖尿病保健茶样品中筛查出3种非法添加的合成药物(格列齐特、格列美脲和格列酮).试验结果表明，灵敏度在ng/g水平，总分析时间不超过1.0 min，并提出了一种功能化的NFsM与DART-MS直接结合的新型筛选模式，有望成为食品安全分析的一种通用方法.

2.7 离子迁移谱技术(IMS)

IMS通过不同的离子漂移时间实现对离子的分离定性[30]，与传统的质谱、色谱法比较，IMS技术分析时间短，无溶剂和气体的使用，灵敏度高.常用于小型、微型化方面，并具有以下优点：(1)不需要真空系统，装置较小.(2)灵敏度极高.在不加任何富集的情况下，IMS就可以达到pg量级，使其适用于现场在线快速分析.(3)可实现对同分异构体等的区分.现有研究中广泛应用于爆炸物、毒品和化学毒剂检测等方面，在保健食品中非法添加物检测方面的应用研究较少.Feng X等[31]通过IMS快速检测保健食品中非法添加的7种Ⅴ型磷酸二酯酶抑制剂(西地那非、那红地那非、他达拉非、氨基他达拉非、伪伐地那非、那莫西地那非、二乙胺他达拉非).Jiao等[32]通过IMS建立改善睡眠类保健品中非法添加物(苯巴比妥、异戊巴比妥、司可巴比妥)快速检测方法，并通过LC-MS进行了确认.

2.8 表面增强拉曼光谱技术(SERS)

拉曼光谱是表征分子的特征结构的一种分子振动光谱.但是由于拉曼散射效应过程较弱，一般都通过某种增强效应实现对表面吸附物的拉曼光谱研究.张建红等[33]建立的抗疲劳类保健品中非法添加化学药物的检测方法中应用了拉曼光谱技术，并对市售抽样送检的保健品进行测试，准确率达95%以上.吴国萍[34]等通过SERS中自制纳米金表面增强试剂研究了对21种保健品样品中的非法添加物西地那非的快速检测，筛选出最佳配比的纳米金和不同浓度的盐酸、硝酸和硫酸作为助剂.试验结果表明，该自制表面增强试剂可检出西地那非的质量浓度为0.01 μg/mL.

2.9 溶剂微萃取技术结合表面增强拉曼光谱法(SME-SERS)

Li等[35]采用溶剂微萃取技术结合表面增强拉曼光谱技术，建立了一种快速、准确地检测保健品中阿替洛尔(ATN)、盐酸二甲双胍(MET)、盐酸苯甲双胍(PHE)等非法药物添加剂的方法.试验结果表明，以甲醇-氯仿(体积比为1∶4)为混合萃取剂适用于非法药物添加剂的快速微萃取分离，并能诱导氯仿表面的银胶体分布.更重要的是，甲醇在此过程中可以携带药物分子进入银胶体的颗粒间，从而显著提高非法药物添加剂的检测灵敏度，进一步减少可能的干扰，以银胶为活性底物，通过微萃取法分离不同保健品中的非法药物添加剂，同时便携式拉曼光谱仪可实现原位检测.

2.10 核磁共振波谱技术(NMR)

NMR是将核磁共振现象应用于测定分子结构的一种技术，主要研究原子核1H(氢谱)和13C(碳谱)的波谱.通过核磁共振波谱化学位移可以获取分子中化学官能团的数目和种类等信息，在蛋白质以及小分子化合物的结构解析中较为常见.Hachem等[36]将1H-NMR技术应用于检测天然减肥保健品中非法添加的化学药物，通过LC-MS/MS验证NMR结果，结果表明1H NMR方法可准确检测保健食品中非法添加的化学药物.

3 总结与展望

目前，保健食品中非法添加物检测研究基于色谱-质谱联用，其中TOF-MS和离子阱质谱成为更加有效的分析技术.随着现代化仪器的飞速发展，对保健食品中化学药物及非法添加物的检测，甚至痕量添加物的检测、定性定量检测和筛查方面均取得了较大的进步，但是这些仪器具有价格昂贵且运行维护成本高的问题.随着研究的发展，期望在前处理及分析方法领域取得突破.

随着我国社会经济的跨越式发展，食品安全已成为关系到国计民生的重要问题，而对保健食品的安全控制现已纳入我国现行的食品卫生检验标准.在对保健食品实行严格监管过程中，对其中非法添加物检测的前处理方法及分析技术研究值得深入进行，建立高效、简洁的多指标、全方位检测方法迫在眉睫.