孕期营养状况与非综合征型唇腭裂的相关性研究

卜秀芬，丁思意，罗业超，李红玉，李世红，贺 骏

（长沙市妇幼保健院遗传优生科，长沙 410007）

非综合征型唇腭裂（Non-syndromic cleft lip with or without cleft palate，NSCL/P）是指单纯的唇裂、腭裂或唇裂合并腭裂的临床表现，是先天性颌面部发育畸形［1-2］。我国唇腭裂在活产儿中的发生率约为1.39～1.46/1000，其总的发生率约占所有围产期出生缺陷的11.43%，位列第三［3-4］。NSCL/P 是具有显著遗传异质性的多基因疾病，环境和遗传因素交互作用是重要的致病原因［5］。有研究显示，患儿MTHFR 及MTRR 基因多态性位点与NSCL/P 发生存在相关性［6］。MTHFR 基因编码5，10-亚甲基四氢叶酸还原酶，MTRR 基因编码甲硫氨酸合成酶还原酶，这两种酶为叶酸代谢的关键酶［7］。胚胎发育过程中，叶酸在外胚层上颌突、球状突等融合过程中起重要作用［8］。不同个体间MTHFR 及MTRR 两基因的多态位点基因型差异，可引起叶酸在体内代谢的差异。母体孕期营养状况是影响胎儿宫内发育很重要的环境因素。孕期母体营养素研究包括钙、铁、锌等矿质元素以及叶酸等维生素［9］。各地区、各民族NSCL/P 研究结果呈现差异性。因此，深入探讨湖南地区孕妇营养素水平及母体MTHFR、MTRR 基因多态性与胎儿NSCL/P 发生的关系，具有重要的实践意义。

1 资料与方法

1.1 一般资料2017 年4 月～2019 年6 月，在长沙市妇幼保健院就诊的孕妇样本，孕妇年龄18～38 岁，单胎妊娠。实验组：确诊NSCL/P 胎儿孕妇71 例，孕周22w+～26w+；对照组：孕正常胎儿孕妇109 例，孕周22w+～28w+。病例组及对照组血液标本均已获得孕妇书面知情同意。

1.2 方法

1.2.1 问卷调查问卷调查的主要内容见下表：

1.2.2 营养素检测采集孕妇外周血，分离血清，采用电感耦合等离子体-质谱法（ICP-MS）检测血清锌和血清铜含量；采用比色法检测血清总钙含量；采用络合指示剂法检测血清镁含量；采用电化学发光法检测血清铁蛋白含量；采用串联质谱法检测25-羟基维生素D含量，以上检测委托长沙金域医学检验所检测。采集孕妇外周血，EDTA 抗凝，获得全血，采用磁微粒化学发光法测定全血红细胞叶酸浓度（试剂盒购自山东优生医疗科技有限公司）。

1.2.3 叶酸代谢相关基因检测采集孕妇外周血，并提取DNA，采用实时荧光PCR 法检测MTHFR 基因C677T、A1298C 位点和MTRR 基因A66G 位点（试剂盒购自苏州旷远生物分子技术有限公司）。

1.2.4 统计学处理采用SPSS 20.0 软件对检测结果进行统计学分析。两组孕妇流行病学调查结果采用χ2检验进行单因素分析，采用Logistic 回归进行多因素分析；两组孕妇营养素平均含量比较，采用t 检验分析；两组孕妇MTHFR 和MTRR 基因位点基因型频率比较采用χ2检验分析。

2 结果

2.1 NSCL/P 发生相关危险因素的单因素分析对调查表中可能与NSCL/P 发生有关联的因素进行单因素分析，发现叶酸服用不足、服用抗生素和唇腭裂家族史3 个因素与NSCL/P 发生有显著相关性（P＜0. 05），孕妇高龄妊娠、不良生活习惯与NSCL/P 的发生无显著相关性（P＞0. 05）（表1）。

表1 NSCL /P发生相关因素单因素分析

2.2 NSCL/P 发生相关危险因素的Logistic 回归分析

在单因素分析的基础上，将NSCL/P 发生有关联的3个因素（叶酸服用不足、服用抗生素和唇腭裂家族史）进行多因素Logistic 回归分析，发现叶酸服用不足是NSCL/P 的独立危险因素（表2）。

2.3 母体营养素水平与NSCL/P 发生的关联分析采用t 检验对检测数据进行分析，发现血清锌含量与NSCL/P 发生具有极显著相关性，P＜0.01，数据符合正态分布（图1A）。血清25-羟基维生素D 含量与NSCL/P 发生有显著相关性，P＜0.05，数据符合正态分布（图1B）。红细胞叶酸含量与NSCL/P 发生亦有显著相关性，P＜0.05，数据符合正态分布（图1C）。其他营养素含量与NSCL/P 发生未发现显著相关性。

表2 NSCL/P发生相关因素的Logistic回归分析结果

图1 孕妇营养素平均浓度比较图（A：血清锌；B血清25-羟基维生素D；C：红细胞叶酸）

2.4 MTHFR 和MTRR 基因型分布情况分析经Hardy-Weinberg 遗传平衡检验，入组样本具有本区域群体代表性（P＞0. 05）。通过χ2检验比较两组孕妇MTHFR基因C677T、A1298C 位点和MTRR 基因A66G 位点基因型构成情况，未发现显著相关性（P＞0. 05）（表3）。MTHFR和MTRR 基因位点基因型构成反应孕妇叶酸利用能力。MTHFR 677 位点CT 和TT 基因型及MTHFR 1298 位点CC 基因型造成MTHFR 酶活性降低；MTRR 66 位点AG和GG 基因型造成MTRR 酶活性降低。

表3 MTHFR C677T、MTHFR A1298C和MTRR A66G位点基因型频率比较%［n（%）］

3 讨论

胎儿唇腭裂多数可在孕中期通过超声、MRI 等方法诊断。我国NSCL/P 患儿出生后需进行多次手术，治疗持续时间长，很多持续到青年期，且经济支出较高，普通家庭难以承担。除吮奶困难等生理方面的影响外，部分NSCL/P 患儿有学习困难、自我认知差、社交恐惧等问题［10］。唇腭裂患儿母亲也更容易陷入焦虑、抑郁、羞辱等负面情绪［11］。目前，我国胎儿期四维彩超诊断出NSCL/P 后，孕妇综合多方面考虑多数会选择终止妊娠，这对孕妇及家人都会造成较大伤害。大量研究显示，孕期不良生活习惯、化学因素、年龄及健康状况等在NSCL/P 发生过程中起着不可或缺的作用［12］，本研究经多因素Logistic 回归分析，显示叶酸服用不足是影响NSCL/P 发生的独立危险因素，与文献报道相符。

目前，探讨孕期矿质元素与NSCL/P 发生关系的研究比较少，且均采用传统的火焰原子吸收法进行研究。锌是体内多种酶的必需组分或激活因子，锌紊乱主要是干扰正常染色质重组和基因的表达，调节细胞复制、细胞分化等过程，从而影响胎儿的发育［13］。本课题是首次利用ICP -MS 法探讨血清锌浓度与NSCL/P 发生关系的研究，ICP-MS 法是一种质谱型元素分析方法，是多元素测定领域中先进、准确、高灵敏度的分析测试手段。本研究结果显示，孕妇的血清锌含量与NSCL/P 发生确实存在极显著相关性。但病例组血清锌水平相对较高，与文献报道的结果不符。可能原因是：（1）对照组选取的是孕22w+-28w+的孕妇，平均孕周较病例组大两周。孕妇孕周越大，血容量增加，导致血清锌浓度偏低。（2）宋庆高［14-15］等研究，均是采用回顾性分析方法。因矿质元素代谢快，孕妇生产后元素水平不能准确地反映孕期的情况。25-羟基维生素D 在体内转化成具有生物活性的1，25-羟基维生素D3 后，与胞内的维生素D 受体（VDR）结合发挥活性，可维持正常角化细胞的结构和体内矿物质平衡［16］。本研究显示，维生素D 含量与NSCL/P 发生亦存在显著相关性。病例组孕妇出现高锌、低维生素D 水平的可能原因是［17-19］：（1）锌元素对VDR 和类视黄醇X 受体形成的调节作用；（2）25-羟基维生素D 与锌在细胞水平的相互作用。综上，本研究中得出的孕期矿质元素与NSCL/P 发生关系的结果相对可靠，但病例组孕妇出现高锌、低维生素D 水平的机制也有待进一步验证和探讨。

本研究显示，叶酸服用不足是NSCL/P 发生的独立危险因素，且红细胞叶酸含量与NSCL/P 发生存在显著相关性。本研究从孕NSCL/P 胎儿母体角度出发，探讨MTHFR 及MTRR 基因多态性与NSCL/P 发生的关系。结果显示，孕NSCL/P 胎儿组与对照组MTHFR 和MTRR基因多态性比较无显著差异。分析可能的原因：本研究中，孕NSCL/P 组与对照组在叶酸制剂的摄入上存在统计学差异，即在叶酸摄入差异的背景下，孕期叶酸的摄入差异可能会干扰分析这些基因多态性位点与NSCL/P之间的真实相关性。孕妇对叶酸的需求量约为正常人的4 倍，孕妇缺乏叶酸与多种自身及新生儿并发症发生有关［20］。MTHFR 基因编码的酶可介导同型半胱氨酸的清除，影响DNA 合成及修复。MTRR 基因编码的酶活性下降，机体对叶酸的吸收利用能力降低，易引起叶酸缺乏，进而引起相关并发症。对MTHFR 和MTRR 基因相关位点的检测，可以直接发现被检者叶酸利用能力缺陷，并根据风险高低科学准确地补充叶酸剂量。孕期通过对孕妇进行叶酸代谢基因检测，个性化地指导孕妇补充叶酸，可有利于降低NSCL/P 的发生。