乙醇萃取法提取石榴皮单宁以及除藻研究

崔庆飞 刘诺晨 路 歌 高云霞

(河北建筑工程学院 市政与环境工程系，河北 张家口 075000)

0 引 言

蓝藻水华是夏季湖泊、水库等缓流水体最常见的水污染现象之一.由于水体中氮、磷元素的影响，造成了水体浮游藻类的大量生长，严重影响了水体的使用性[1-2].研究科学治理水华的工艺迫在眉睫.

除藻的方法大致分为物理除藻、化学除藻、生物控藻三种[3-4].物理除藻包括机械除藻、气浮除藻、过滤除藻、遮光除藻、超声波除藻和黏土除藻[5]等；化学除藻包括化学药剂除藻、絮凝剂除藻和生物化学除藻；生物控藻包括水生生物控藻和微生物控藻.物理、化学法只是应急处理措施，长久使用成本较高，且有二次污染的风险.生物法可以长期有效，但是局限性很大[6].目前，国内外以生物化学法除藻和生物控藻为研究方向[7-8].

生物化学法是从高等植物中提取有效成分，使其作为水处理剂来使用.本实验采用生物化学的方法，提取单宁的方法有很多，能够实现工业化大规模的首选溶剂萃取法.选用石榴皮作为实验材料，用乙醇溶液作为萃取剂，提取其中的单宁酸以及絮凝除藻.

1 实验材料与方法

1.1 实验材料及仪器

实验提取所用的材料石榴皮是安徽亳州的.将收集到的石榴皮晒干，粉碎，过70目的分样筛，将收集到的粉末用恒温烘干箱烘干保留.实验所用的藻类是从中国科学院水生生物研究所选购的藻种编号FACHB-905的铜绿微囊藻(Microcystis aeruginosa)，该藻种是1998年昆明滇池中分离出来保存的，铜绿微囊藻是夏季蓝藻水华典型的优势藻种.藻种的扩大培养选用的BG11培养基，培养条件参照藻种库所推荐的：培养温度25 ℃，光照强度2000 lux 2M，光暗比12 h：12 h.实验藻种在此条件下培养4～6天，避免培养时间过长出现大量褐色死藻[9].

使用的药剂有无水乙醇，硫酸亚铁，磷酸二氢钾，氢氧化钠，标准单宁酸，氯化钠，酒石酸钾钠，丙酮，BG11培养液.主要仪器有紫外分光光度计，砂芯抽滤装置，离心机，生化培养箱等.

1.2 实验方法

称取5 g的石榴皮粉末，放入100 mL的萃取剂中.考虑到萃取的影响因素较多，为了实验方便，采取正交实验的方法，选取多组具有代表性的实验组来完成.正交设计表如下：

表1 正交实验的因素和水平

经萃取后过滤，留存滤液并用同浓度的萃取剂冲洗残渣补充滤液至100 mL.使用酒石酸亚铁比色法来检测萃取的单宁酸含量[10].用提取液按一定比例来做藻类的絮凝实验.配制酒石酸亚铁溶液和pH值为7.4的磷酸盐缓冲液，用于单宁酸量的检测.将培养的藻类以7000 r/min的转速离心10 min，将藻细胞用蒸馏水配制成溶液，在紫外分光光度计680 nm处测其吸光度为0.100.加入一定量的提取液于定量的藻溶液中，絮凝沉淀约8 h，测其上清液中叶绿素a的含量来分析去除效果.

1.3 检测方法

单宁酸的测定用酒石酸亚铁比色法：绘制标准曲线，不同浓度标准单宁酸溶液分别加入酒石酸亚铁试剂和pH为7.4的磷酸盐缓冲液，混合摇匀呈现紫黑色.测定其吸光度.标准曲线的线性回归方程为c=0.5219A-0.018 R2=0.9997(c为溶液单宁酸的浓度，A为溶液吸光度).待测样品的单宁酸含量用上述方法测定.

叶绿素a的测定采用HJ 897-2017分光光度法：将待测样品用滤膜过滤截留藻类，研磨破碎藻细胞，用丙酮溶液提取叶绿素，3500 r/min离心后分别于750 nm、664 nm、647 nm、和630 nm波长处测定提取液吸光度，待测样品的叶绿素a浓度根据下列公式计算：

c=11.85×(A664-A750)-1.54×(A647-A750)-0.08×(A630-A750)

式中：c为叶绿素a的浓度(mg/L)，A750、A664、A647、A630分别为检测样在750 nm、664 nm、647 nm、630 nm波长处的吸光度.

除藻的效果以叶绿素a的含量来反应，去除率的计算公式为：

(1)

式中：η为单宁酸对铜绿微囊藻的去除率，c为加入单宁酸后叶绿素a的浓度(mg/L)，c0为对照组叶绿素a的浓度(mg/L).

2 实验结果分析

2.1 单宁酸提取正交实验

表2 正交实验设计及结果分析

为保证正交实验数据的可靠性，正交实验重复做了四次.从正交表中的极差分析可以看出，三种因素对单宁酸提取的影响主要顺序是A>C>B，即乙醇的浓度(%)>萃取温度(℃)>萃取时间(h).溶剂萃取法提取工艺的最佳组合条件为A2B1C3，即乙醇浓度为50%、萃取时间2 h、萃取温度60 ℃.该组合在正交表中实验号4的位置，对比表中其他数据，该种组合下的提取率是最大的，单宁酸含量为19.0%.

2.2 验证实验

根据正交表得出的组合再次进行实验验证，结合之前的四次实验的四组数据分析

表3 实验最佳组合数据分析

根据四次正交实验的数据和验证实验共五组数据分析结果如表3所示，最佳组合条件下，乙醇溶剂萃取法所提取的单宁酸含量为18.96%、19.12%、19.07%、18.84%、19.04%，平均提取率为19.01%.实验分析SD=0.098，RSD%=0.52%(N=5).由此数据可看出，相同条件下每次提取所得的含量波动不大，实验结果准确.正交实验结果准确可靠.

对比H.-Q.Wang等学者[11]研究的丙酮萃取法提取石榴皮中的单宁酸含量为22.2%，乙醇萃取法的萃取效果欠佳.以丙酮和乙醇为萃取剂以最佳条件多次提取单宁酸[12]：(丙酮萃取条件为丙酮浓度为70%，萃取时间为3 h，萃取温度设置为60 ℃).

表4 石榴皮单宁含量

由表4可以看出该种石榴皮中单宁酸的含量约为25.45%～26.58%左右.

2.3 除藻实验

除藻实验所用的单宁酸溶液来源于验证实验中的第五组，单宁酸含量19.04%，萃取液浓度为9.52 g/L.同时用化学试剂标准单宁酸来配制相同浓度的对照液来进行除藻实验的研究.

取在吸光度在680 nm处为0.100的藻液49 mL放置于小烧杯中，将单宁酸萃取液和标准液按照倍数稀释成0.2 g/L、1 g/L、2 g/L、3 g/L、4 g/L、5 g/L、6 g/L的工作液，分别取1 mL加入烧杯中混匀静置，实验设置三组平行组，时间为8 h左右，测其上清液中的叶绿素a的浓度，计算其去除率.

图1 不同投加量下的除藻效果对比

从图1中可看出，单宁酸萃取液的投加量在4 mg时去除率已经达到98.52%，相同投加量下的单宁酸标准液去除率为96.49%，已经达到去除效果.石榴皮单宁酸萃取液和单宁酸标准液在去除率趋势上是一致的，实验发现萃取液的去除率都略微优于标准液，可能是在萃取过程中溶入了石榴皮中的其它活性成分，对藻类同样有絮凝沉淀的作用，而两种工作液的去除率区别不大，可能是其它活性成分的作用效果不佳或者是成分含量极少的缘故，例如多糖、多酚、酮类等[13].

3 结 论

(1)通过正交实验的结果可知，乙醇溶液萃取石榴皮单宁酸的影响因素程度大小为浓度>温度>时间，该方法下的最佳萃取条件为乙醇浓度为50%、萃取时间2 h、萃取温度60 ℃；该条件下的萃取含量约为19.0%.

(2)验证实验分析结果为该工艺的平均提取率为19.01%.实验分析SD=0.098，RSD%=0.52%(N=5).经多次重复提取，实验材料所用的石榴皮单宁酸含量在25.45%～26.58%左右.

(3)根据除藻实验的数据分析，浓度为4 g/L的单宁酸萃取液1 mL可以作用于50 mL的藻类水样，去除率为98.52%.标准单宁酸4 mg可以作用于50 mL的藻类水样，去除率为96.49%.

4 展 望

含有单宁酸的大多为树皮和果实的外皮[14-15]，原料廉价易得.植物单宁除了可以作为絮凝剂之外，还可以做阻垢剂、抗氧化剂、抑菌剂等等[16].

单宁酸易溶于丙酮、乙醇和乙酸乙酯等有机溶剂中，对比这几种常见的有机溶剂可发现，在价格方面乙酸乙酯>乙醇>丙酮，萃取效率乙酸乙酯>丙酮>乙醇[17]，萃取剂损失率乙醇>乙酸乙酯>丙酮，循环回收率乙醇>丙酮>乙酸乙酯.综合上述因素分析，价格方面乙酸乙酯的使用成本是丙酮的两倍左右，虽然萃取效率最高，但是应用于工业化并不合适，并且萃取的效果与其他两个萃取剂相差不是太多；而考虑到萃取到的单宁酸将作为絮凝剂来使用，并不提倡具有毒性的丙酮来提取，同时相同条件下，乙醇作为萃取剂，蒸发损失率最低，且易于回收重复利用，是工业化提取植物单宁酸的首选萃取剂.