细胞3D培养技术及其在水产养殖上的应用

唐 旖，蔡 灵，杨 明

(1.自然资源部第三海洋研究所，福建 厦门 361005；2.上海大学环境与化学工程学院，上海 200444)

细胞培养作为研究细胞生物学乃至生物学的技术之一，在生命科学研究领域占有重要地位。自Roux于1885 年从鸡胚中分离细胞并首次建立体外细胞培养以来，单层细胞培养技术已有百余年的历史[1]，而且已经在遗传学、免疫学、实验医学和肿瘤学等各个领域内取得了巨大的成果[2]。水产动物的细胞培养始于20世纪60年代，其中最具有代表性的是鱼类细胞的体外培养技术。Wolf和Quimby建立了世界上第一个鱼类细胞系，即虹鳟鱼生殖腺细胞系(RTG-2)。目前，鱼类细胞培养技术已经成为鱼类生物学研究领域中一种重要的研究手段，除了被广泛应用于鱼类细胞建系外，还被应用于鱼类胚胎干细胞、鱼类病毒学、鱼类免疫学、鱼类细胞因子与生长因子、鱼类毒理学和肿瘤(癌)学、鱼类内分泌学、鱼类细胞工程、遗传育种与基因工程、抗病毒药物与药物检测、鱼类资源保护等方面的研究[3]。

长期以来，细胞的体外培养一直是在培养皿或培养瓶的二维平面上进行的。然而越来越多的研究发现，在二维的玻璃或聚苯乙烯底物上生长的真核细胞与体内三维结构中的真实细胞状态有很大不同，如细胞与细胞、细胞与基质间的相互作用、细胞分化等方面[4-6]。为了更好地模拟细胞在体内的生长模式，3D细胞培养技术逐渐发展起来并被越来越多的研究者所接受。3D细胞培养技术最初的设想是设计一个生物相容性微孔支架，让细胞在支架中生长，模拟其在体内的3D状态[7]。但随着研究的深入，不同的参数被考虑加进培养系统，包括细胞的类型、支架材料的选择、特殊用途的需要等，这使得3D培养系统的复杂性越来越高。如今，3D细胞培养技术已经在神经细胞、癌症和干细胞等许多领域被广泛应用，3D培养系统也已发展得多种多样，并仍在不断改进和创新。本文在介绍国内外大量已有的相关研究成果的基础上，对3D细胞培养技术的特点、发展历程和应用进行了简单的总结，并对3D细胞培养技术在水产养殖上的应用前景进行了简介和展望。

1 3D细胞培养的发展历程

1.1 二维(2D)细胞培养的局限性

传统的细胞研究大多采用2D培养的方式，细胞在二维平面上呈单层生长。但这种培养方式与细胞在体内所处的3D环境有很大区别，二维的平面使细胞失去了原来特定的形态功能特征和分化能力[4]。

2D与3D细胞培养相比，最明显的区别在于没有细胞外基质(ECM)的作用。ECM是多细胞有机体中，细胞周围由多种大分子组成的复杂网络。它含有胶原蛋白、弹性蛋白和层粘连蛋白等蛋白质，这些蛋白质赋予组织机械特性，并帮助组织基质内细胞之间的通讯[6]。ECM并非仅仅起惰性支持物的作用，或者将细胞连接在一起，形成组织器官，而是含有大量信号分子，积极参与控制细胞的生长、极性、形状、迁移和代谢活动[8]。

关于2D细胞培养的局限性，很早就有研究者进行相关报道。Lanotte等[9]在进行造血细胞的研究培养时发现，细胞可以附着在固体基质上，并保持其功能活性，这意味着诱导环境中的一些细胞成分可能会丢失，而且细胞间相互作用的能力可能会降低。另外，也有很多研究表明，2D环境中培养的细胞与3D培养的细胞在组织结构、形态功能方面有很大差异，3D细胞表现出更符合体内真实的状况。例如，在神经细胞的研究中，神经干细胞通常在培养皿中作为漂浮的聚集体或附着在培养皿表面的单层膜进行扩增。虽然用这些方法培养细胞被证明是一种有效的扩大细胞的方法，但这些系统也限制细胞生长到固定的几何形状，特别是在单层膜的情况下，细胞只在二维平面中扩大。这种形态的改变可能会对细胞的原有功能产生影响[10]。

1.2 3D细胞培养的发展

早在20世纪70—80年代就有研究者断断续续地开始了细胞3D培养的探索。3D细胞培养的最初设想是设计一个生物相容性的微孔支架，细胞在支架中呈三维悬浮生长。胶原蛋白是其中应用较早的支架材料之一，它是哺乳动物体内含量最为丰富的动物蛋白，也是细胞外基质的主要组成化合物，因为具有良好的生物相容性、可生物降解性以及生物活性，所以其在食品、医药、组织工程等领域获得广泛的应用[11-12]。Kleinman团队在20世纪70年代就对各类胶原蛋白的形态、结构、功能及其与细胞之间的作用关系进行了系统的研究，包括细胞粘附、蛋白与细胞的结合、胶原基质的制备等[13-18]。最开始被应用于细胞培养的胶原蛋白是从小鼠体内的提取的[19]。Lanotte等[9]用0.5 mol/L乙酸从大鼠尾腱中提取了I型胶原，并用以胶原与培养基按比例混合的简单方法来进行造血细胞的3D培养。随后，胶原蛋白被从各种不同的动物组织中提取出来并用于细胞培养。

但是由于来源不同的细胞及其周围的环境的差异性，这种简单的方法不能很好地适用于所有细胞的3D培养，于是有研究者提出了改良方法。组织工程支架就是一种较为基础的方式，它由生物材料或合成聚合物制成，能提供生物功能信号并与细胞良好地相互作用，同时能实现对结构性质的精确控制。Almany等[20]描述了一种由纤维蛋白原主链组成并与双官能聚乙二醇(PEG)侧链交联的生物合成杂合支架。

从长远来看，许多研究人员希望避免使用从活组织中提取材料，因为这些材料可能因批次的不同而出现差异，很难根据特定实验的需要进行定制，因此大量的人工合成材料引起了人们的关注。Sun等[21]研究了三维电纺纤维支架的纤维直径和纤维间距对人真皮成纤维细胞行为的影响。他们将两种不同模型材料聚苯乙烯和聚乳酸制成直径范围较宽的纤维，在专门研制的三维细胞培养系统中构建。该方法确定了电纺支架设计的一些基本微结构参数和成纤维细胞三维生长的一些关键差异。另一种通常使用的支架材料是聚乙二醇(PEG)，因为它容易被官能化。Loessner等[22]采用了高度灵活的全合成PEG基支架，由8臂PEG组成，通过微调不同组分，获得具有不同硬度的水凝胶。

除凝胶和支架外，近些年还出现了一些新型的3D培养模型，如3D细胞微流控系统和磁力悬浮系统。3D细胞微流控系统通过将模拟细胞外基质复杂生物化学和几何形状的表面与调节液体和可溶性因子运输的微流体通道相结合，为细胞生长和刺激的时空控制创造了新的机会[23]。Ong等[24]提出了一种在不使用水凝胶的情况下在微流体系统中三维接种和培养哺乳动物细胞的新方法。用一种瞬时细胞间聚合物接头和微制造柱阵列的组合在微流体通道中形成和固定3D多细胞聚集体，这种方式减少了用于细胞支持的水凝胶的嵌入。

2 3D细胞培养技术在水产养殖上的应用

水产动物的细胞培养是从20世纪60年代开始慢慢发展起来的，起初主要被用于病毒的分离和纯化，目前这项技术已被广泛应用于鱼类细胞、贝类外套膜上皮细胞等的培养。细胞的3D培养技术也是一项在细胞培养的基础上发展起来的新技术，目前在癌症[25]、神经干细胞[26]、心脏细胞再生[27]等方面发挥了重要作用。虽然因为发展时间较晚，3D细胞培养技术在水产动物的细胞培养方面还鲜有报道，但这项技术的应用应引起重视。

2.1 3D细胞培养技术在鱼类细胞培养上的应用前景

鱼类细胞的培养始于20世纪60年代，之后各种鱼类的细胞系相继建立，到目前为止，国内外报道的鱼类细胞系已经超过280株。与哺乳动物的细胞培养相比，鱼类细胞的培养比较容易，对传代培养时间的要求弹性比较大，适温范围广，经过几十年的发展，已被广泛应用于鱼类病毒学、水产养殖、鱼类生理和免疫学以及资源保护等方面[28]，尤其在对鱼类病毒的预防和治疗上发挥了很大作用[29]。

鱼类细胞培养与其他动物细胞培养一样，总体上可分为原代培养和传代培养。一般来说，传代培养的细胞在经过几次传代后，会逐渐失去原细胞的生理生化功能特性，而原代培养的细胞仍能保留部分同在体内细胞一样的生理功能特性[30]，因此，原代细胞更适合用来进行相关的鱼类学实验。但即使是原代培养的细胞，也受到很多限制，在实践中，短期培养的鱼类细胞功能基因可以正常表达，但是长期体外培养条件下的细胞会丢失许多功能。这可能是由于体外培养的细胞缺少在体内条件下的ECM环境和有效的细胞间相互作用所造成的，而3D细胞培养系统能给鱼类细胞创造一个类似于鱼体内的悬浮环境，使细胞长期保持原有的生理功能和特性。用胶原凝胶作为支架进行鱼类细胞的3D培养或许是一个可行的方法。Falguni等[31]从淡水鱼中提取了胶原蛋白并首次研究了这种胶原蛋白的生物相容性和免疫原性，他们用这种胶原蛋白支架进行了3D细胞培养实验，结果显示鱼胶原蛋白支架表现出和牛胶原蛋白相当的细胞活力，表明源自淡水的鱼胶原支架在性质上具有高度生物相容性。Choi等[32]用静电纺丝法制造了一种由鱼胶原蛋白(FC)和聚己内酯(PCL)混合物组成的新型纳米纤维支架，这种新型支架以鱼胶原蛋白的含量来控制纳米纤维的直径大小，以支架结构促进细胞粘附、扩散、突起和增殖，为鱼类细胞的3D培养提供了潜在的平台。

2.2 3D细胞培养技术在贝类上的应用前景

对贝类的组织和细胞进行培养始于20世纪70年代，已报道的关于贝类的组织培养主要集中在文蛤、牡蛎等常见贝类[33-35]。外套膜是珍珠贝孕育珍珠的场所，是珍珠贝插核形成珍珠的必要条件，目前插核所用的外套膜大多采自于珍珠贝活体膜。关于贝类外套膜组织的离体培养已有很多尝试，相关研究证明，离体条件下培养的珍珠贝外套膜组织和自然状态下的一样，都能分泌丰富的珍珠质[36]。用3D细胞培养技术对珍珠贝的外套膜组织进行离体培养，将有利于减少珍珠贝的使用量，从而增加经济效益。

贝类养殖是水产养殖业的一个重要部分，贝类细胞的3D培养技术还可以被用于贝类病毒的研究。体外培养的细胞是进行病理和免疫机理研究的良好素材，不仅可以被用于鉴定病毒，还可以被用于研究病毒的感染、复制、形态发生和遗传变异等。此外，通过培养贝类的免疫细胞，可进行贝类免疫机制的研究和筛选增强免疫机能的活性物质或药物[37]。因此，细胞的3D培养技术应用对贝类的疾病防治可能具有重要意义。

3 展望

在各种研究数据的支持下，3D细胞培养模型优于2D传统培养已经成为共识。与2D培养相比，3D培养中的细胞更接近于与细胞形状和环境有关的体内情况，已被用于研究多种组织和细胞，包括前列腺、乳腺、肌肉、结肠、食道、成纤维细胞和胚胎干细胞等。3D培养技术虽然具有明显的优势，但在应用方面仍不够成熟。对不同来源的细胞需要形成不同的模拟环境，这需要相对复杂的条件和技术。但可以预见的是，随着材料科学和生物工程技术的发展，3D细胞培养技术将会越来越成熟。水产动物的细胞培养在近些年发展快速，但同时也面临着一些问题，而3D培养系统为细胞培养提供了一种新思路，将会有力地推动水产养殖业的发展。