EMS对工业大麻汾麻3号种子萌发的影响

冯旭平，康红梅，赵铭森，高金虎，孟晓康，薛红丽

（山西农业大学（山西省农业科学院）经济作物研究所，山西汾阳032200）

大麻（Cannabis L.）是一种古老的经济作物，为大麻科大麻属1年生草本植物，按用途可分为纤维用大麻、籽用大麻和药用大麻[1]。大麻纤维具有抑菌、抗紫外线辐射、抗静电等特性，可被应用于纺织、造纸和汽车内饰[2]。大麻籽中油脂和蛋白质含量较高，可用来制作蛋白粉、大麻油等。其花叶含有的大麻二酚（CBD），是一种无精神活性的酚类物质，在医学上具有减轻惊厥、炎症、焦虑和呕吐的作用，也可缓解肿瘤化疗带来的不适反应，抑制癌细胞生长。目前，市面上已有的防治艾滋病、精神疾病等方面的药物如屈大麻酚、大麻隆和Sativex等，它们中都含有CBD成分。另外，大麻植株中含有的酚类物质及其衍生物，也可阻碍细菌等微生物代谢作用和生理活动，因而，可被用于抗紫外线、抗氧化的护肤产品[3-5]。

大麻多样化的用途促进了大麻产业的快速发展。但大麻植株中含有一种叫四氢大麻酚（Tetrahydrocannabinol，THC）的酚类物质，它是一种精神活性物质，属于“毒品”管制的范畴，人体吸入后会出现幻觉、妄想、双重人格等[6]。因此，大麻的栽培、种植、应用受到严格的管制。国际上把THC含量小于0.3%的大麻称为工业大麻，具有加工利用价值的工业大麻，必须在一定管制条件下可规模种植生产。目前，我国只有云南、黑龙江两省制定了工业大麻种植、加工的地方法规，在这2个省的政府监管下可进行种植。其他省份只允许纤维、籽用工业大麻的种植。

我国现存的大麻种质资源比较匮乏，如地方品种河南的固始麻、安徽的皖大麻等基本上是作为纤维麻来种植，不可或不适宜作籽用、药用；同时由于地理因素的限制，不适宜在其他地方种植。因此，培育THC含量低（小于0.3%）的高油、高蛋白、高CBD专用型工业大麻新品种，丰富工业大麻遗传种质资源迫在眉睫。一般来说，通过物种的自然变异获得新品种的速度慢、时间久、频率小。随着科学技术的发展，可以通过人工手段加快物种的变异，如利用射线进行辐射的物理诱变、利用化学药剂进行化学诱变、送入太空进行太空辐射等，各种方法各有优劣。其中，运用化学诱变剂甲基磺酸乙酯（Ethyle methanesulfonate，EMS）来进行诱变是一种较为简便、经济、易操作的诱变方法。EMS可以通过与DNA核苷酸中的碱基对作用使其结构改变，诱发点突变[7-8]。此诱变方法对植物基因组的改变较小，类似于自然界的自发突变，对作物产生的不利影响较小，故经常被人们用来进行诱变育种。目前，EMS诱变育种已在西瓜、辣椒、黄瓜、水稻、小麦、玉米、马铃薯、油菜、烟草等农作物中广泛被应用[9-10]。EMS诱变具有两面性，需要选择合适的诱变条件来达到需要的诱变目的。

本试验以优良工业大麻品种汾麻3号种子为材料，通过设置不同的EMS体积分数和作用时间，调查统计其发芽率和芽长，来确定汾麻3号种子适宜的诱变条件，以期为下一步的工业大麻种质资源创制、新品种的选育、突变体库的构建等提供参考。

1 材料和方法

1.1 材料

供试大麻品种为山西省农业科学院经济作物研究所大麻课题组选育的籽用工业大麻新品种汾麻3号。该品种植株高大，分枝多，籽粒中等大小，油脂含量较高[11]，适合在山西大部分丘陵山坡地种植。

1.2 试剂

EMS原液购自上海恒远生物科技有限公司。其他试剂购自太原飞达科贸公司，试剂标准为分析纯。

1.3 试验方法

试验于2018年冬季在山西省农业科学院经济作物研究所（汾阳）所内实验室进行。汾麻3号种子在室温下被浸种16 h，再挑选出饱满、成熟度好、未露白的种子进行诱变处理。试验设6个EMS体积分数梯度，即0（CK）、0.5%、1.0%、1.5%、2.5%、4.0%，2个诱变浸种时间（7.5、17.0 h），3次重复，共36个处理。每个处理50粒种子，放于15 mL的一次性离心管中进行诱变处理。诱变处理时将36个处理的离心管置于缓慢振荡的摇床上，使种子与诱变剂充分接触。

各处理诱变结束后往离心管中加入适量1 mol/L硫代硫酸钠溶液来终止诱变反应，过程需10～20 min。取出诱变后的种子放置在流动的自来水下冲洗2 h，从而彻底洗去药物残留。室温下稍微晾干后，再将其装入培养皿置于人工智能气候箱中进行纸上发芽培养。培养皿中滤纸需每天加水保持湿润。人工智能气候箱具体设置为：光级I级（约1 500 lx），光周期为12 h/12 h（光/暗），温度为25℃/20℃（光/暗），相对湿度RH为70%。

每天观察记录各处理种子的发芽情况，并根据发芽率计算相对发芽率。其中，各种子发芽以芽长度大于0.2 cm为标准，具体芽长用1 cm×1 cm方格纸进行测量。基于培养到后期容易产生细菌污染以及芽坏死情况，把培养81 h后的发芽状况作为本试验的最终发芽结果。

1.4 数据分析

试验数据采用Excel 2003和SPSS 22.0软件进行分析；采用两因素随机区组进行方差统计分析。

2 结果与分析

2.1 不同诱变体积分数和诱变时间处理下汾麻3号种子的萌发动态分析

通过观察发现，处理终止后就已经有少量种子露白萌动。在人工智能气候箱培养56 h后就已经有大部分种子发芽，此时CK种子的平均发芽率已达91.45%，EMS体积分数为2.5%的处理种子发芽率也达到45%，芽长达2.92 cm；培养81 h后CK与0.5%EMS体积分数处理的种子发芽率都在90%以上，芽长分别为7.41、8.66 cm。从图1可以看出，在相同的体积分数与处理时间下，随着培养时间的增加，种子发芽率增高，芽长变化规律则不一致，EMS体积分数为2.5%和4.0%的处理，培养81 h时种子芽长高于培养56 h的；而EMS体积分数为1.0%和1.5%处理，培养56 h的芽长则高于81 h的。这可能是由于EMS渗透进入种子内，参与或抑制其不同的发芽过程。另外也可能是每个种子对EMS的拮抗作用不同，因此，这种抑制不具有线性关系。

2.2 不同诱变体积分数和诱变时间处理下汾麻3号种子的发芽情况分析

由表1可知，EMS体积分数为0.5%时，种子的发芽率与对照相差不大，处理时间7.5 h时发芽率为99.00%（相应的CK为93.00%），处理时间17.0 h时，发芽率为96.02%（相应的CK为98.00%）。随着EMS体积分数的增加，发芽率逐渐降低；在EMS低体积分数（0.5%、1.0%、1.5%）时，发芽率分别为99.00%、93.00%、91.00%（处理7.5 h）和96.02%、89.96%、84.00%（处理17.0 h），降幅比较小；在高体积分数（2.5%、4.0%）时，发芽率分别是72.36%、61.00%（处理7.5 h）和41.00%、3.00%（处理17.0 h），后者降幅较大。方差分析结果表明（表2），不同体积分数、处理时间，以及二者互作之间差异极显著，P值分别为0.000、0.000、0.001。其中，不同EMS体积分数处理的种子发芽率从大到小排序为0.5%＞0（CK）＞1.0%＞1.5%＞2.5%＞4.0%。其中，0（CK）、0.5%、1.0%、1.5%之间差异不显著，它们与2.5%、4.0%之间差异显著，2.5%与4.0%之间差异也显著。

表1 不同EMS体积分数和处理时间对汾麻3号种子萌发的影响

表2 不同EMS体积分数和处理时间下种子发芽率的方差分析

芽长的变化规律也类似。由表1可知，随着EMS体积分数的增加，芽长逐渐变小，EMS体积分数为0.5%时，2种处理时间下种子的平均芽长在8.66 cm，在EMS体积分数为1.0%时，芽长为6.13 cm，EMS体积分数为1.5%时，芽长为5.11 cm，在高体积分数2.5%和4.0%时，芽长分别缩短到3.84、2.09 cm。说明EMS体积分数越高越抑制种子胚芽的生长。在不同处理时间下，EMS体积分数为0.5%时，芽长分别是9.28 cm（7.5 h）和8.05 cm（17.0 h），二者相差1.23 cm；在EMS体积分数为2.5%时，芽长分别是5.31 cm（7.5 h）和2.37 cm（17.0 h），二者相差2.94 cm。由此可见，处理时间增加芽长减小，且低体积分数时减小幅度小，高体积分数时减小幅度大。方差分析结果表明（表3），EMS体积分数之间差异极显著（P＝0.000），处理时间以及二者互作之间差异不显著（P＞0.05）。其中，不同EMS体积分数处理的种子芽长从长到短排序为0.5%＞0（CK）＞1.0%＞1.5%＞2.5%＞4.0%。其中，低体积分数0、0.5%、1.0%、1.5%之间差异不显著，但它们与2.5%、4.0%之间差异显著，另外，高体积分数2.5%与4.0%之间差异也显著。

总的来说，在同一处理时间下，随着EMS体积分数的增加，发芽率降低；在同一体积分数下，随着处理时间的增加，发芽率降低。芽长变化规律也类似，随着EMS体积分数的增加，芽长缩短，处理时间长的种子芽长降幅更大。

表3 不同EMS体积分数和处理时间下种子芽长的方差分析

2.3 EMS诱变适宜体积分数和时间条件分析

本试验中，汾麻3号种子在较低体积分数（0～1.5%）时，发芽率相对较高（91%～99%）；在高体积分数（2.5%～4.0%）时，发芽率则降低。从图2可以看出，随着EMS体积分数的增加，种子数量越来越少，芽长也减小。随着处理时间从7.5 h增加到17.0 h，种子数量也明显减少，即发芽率减小，芽长变短。考虑到大麻种子适宜的播种深度为2～3 cm，芽太短不利于出苗，建议EMS体积分数为2.5%、处理时间为7.5 h可以作为相对适宜的诱变条件。

3 结论与讨论

EMS应用于许多作物的诱变育种中。陈煜等[12]研究发现，陆地棉鲁6269的出苗率为49%的诱变条件是1.0%的EMS处理10 h。陈喜明等[13]研究发现，0.8%的EMS处理8 h是芸豆种子的最佳诱变条件。安佰义等[14]利用EMS诱变白桦种子，发现EMS显著抑制种子的发芽率以及发芽起始时间。姜颖[15]研究发现，EMS诱变大麻品种火麻1号种子的适宜浓度为1.5%，处理时间为8 h，格里昂为1.5%浓度和6 h的处理时间；金刀15为1.5%浓度和8 h的处理时间。其研究还发现，EMS对胚根、胚轴的生长有抑制作用。本研究也发现，高体积分数的EMS显著降低汾麻3号种子的发芽率、相对发芽率以及芽长，并且抑制种子的萌发与芽的生长。但是，本研究得出的汾麻3号种子最适诱变条件为：EMS体积分数2.5%、处理时间7.5 h。与前人研究结果比，EMS体积分数相对较高，处理时间较少。这在其他作物上也有类似的研究结果。如杨楠等[16]研究发现，6%的EMS溶液处理12、24 h可作为诱导知母种子建立突变体库的适宜条件。其研究结果中，EMS浓度高达6%。这可能与品种、种子类型以及诱变所用的缓冲液、诱变处理时的温度和种子前处理等有关，也可能与EMS溶液浓度与处理时间的互作效应有关。关于EMS体积分数与诱变时间的互作效应，前人也有发现。程蛟文等[17]研究发现，EMS溶液浓度、诱变时间以及二者交互作用均对苦瓜种子发芽势和发芽率具有显著影响，其半致死条件为：先清水浸种8 h，用1.5%或1.2%处理2 h。姚恒等[18]通过用不同体积分数与不同处理时间诱变烤烟K326种子，得出EMS体积分数1.15%处理12 h或者0.88%处理16 h，或者0.7%体积分数处理12 h或者1.1%体积分数处理8 h都是该品种的半致死条件。

明确EMS诱变适宜条件是开展EMS诱变育种研究的前提。EMS在大麻上的诱变只有少数人进行过研究。考虑到品种与地域的特异性，有必要重新研究筛选确定特定品种的适宜诱变条件，为相关人员开展下一步的诱变育种提供参考。本试验研究发现，较低体积分数（0.5%）的EMS可刺激大麻种子的萌发，使其发芽率、芽长高于对照。另外在本试验中也发现，同一浓度下诱变时间长的发芽率以及芽长高于或大于诱变时间短的情况，可能是由于试验中运用硫代硫酸钠终止反应以及清水清洗药剂不够彻底，导致药物有少量残留所致或者与诱变处理时种子与溶液未充分接触有关或者是EMS诱变剂对该种子的诱变作用并不是表现在抑制芽长方面。

随着市场经济的发展，工业大麻作为一种特殊的经济作物，其基础研究和多功能利用越来越受到重视。种质资源是开展各类研究应用的首要前提，国外的高CBD品种，CBD含量能达到20%且THC又符合国际标准（≤0.3%）。目前，国内的资源大都是纤维用或籽用，可提取利用大麻酚类物质CBD、CBG、THC等方面的种质资源相对欠缺，如作为在云南大规模种植的药用品种云麻8号，CBD含量也未超过2%，而其他省份更未有这方面资源。利用各种手段如EMS诱变等构建其突变体库并结合基因测序等手段，可以快速确定变异基因明确其功能，从而更快速高效地选育出市场需求的各种特性的专用型品种。

本试验结果表明，工业大麻汾麻3号适宜的EMS诱变条件是：2.5%EMS体积分数和7.5 h处理时间。