几种K型不育系及其后代染色体的细胞学分析

李亚莉，侯丽媛，董艳辉，王育川，王亦学

（1.晋中学院生物科学与技术系，山西晋中030619；2.山西农业大学生命科学学院，山西太原030031）

在杂交小麦的育种研究中，将小麦族内的野生亲缘种中丰富的细胞质通过核置换回交的方法转移到栽培小麦，创制出的核质杂种小麦集纯系育种和雄性不育杂种优势2种方法的优点，可以加快育种效率、拓宽小麦品种改良和杂种优势的遗传基础，同时也是开展核质互作遗传关系和细胞质遗传机制研究的理想材料[1]。目前小麦族内已有100多个种的细胞质通过这个方法向普通小麦转移。K型不育系是将普通小麦的细胞核导入粘果山羊草的细胞质中创制而成，在育种实践中，后代产生频率不等的单倍体，严重制约K型不育系在小麦育种中的应用，虽然后代的农艺特征无明显的负作用[2]，但是对于利用K型不育系配制杂交种来说，后代产生频率不等的单倍体是一个不利因素。进一步的研究发现，由于正常的1BS染色体臂被黑麦的1RS染色体臂代换，1RS染色体臂上的基因与特定的异源细胞质互作产生不育[3]，推测可能在组培过程中，1BL/1RS易位染色体上的基因能加速胚胎和愈伤组织的生长，从而提高由小孢子生成单倍体的频率[1，4]。因此，研究核质互作遗传效应高比例的诱导小麦单倍体的机制，有利于拓展异源细胞质诱导小麦单倍体技术在小麦育种实践中的应用价值。

在细胞有丝分裂和减数分裂过程中，着丝粒区特异的组蛋白H3（CenH3）与动粒蛋白结合，在纺锤丝的牵引下正确移动至细胞两极[5]。着丝粒组蛋白H3发生某些修饰或者突变从而导致染色体错分裂，产生非整倍体或者单倍体子代[6]。着丝粒DNA序列一般由夹杂排列的卫星DNA串联重复阵列（tandem repeat，TR）和着丝粒专一的反转录转座子（centromere retrotransposons，CRs）构成。着丝粒组蛋白存在于整个细胞周期中，通过鉴别与着丝粒组蛋白相互作用的DNA序列可确定功能着丝粒的边界和大小[7]。着丝粒反转录转座子也能反过来定位包含着丝粒组蛋白的核小体的分布方式[8]，甚至在着丝粒组蛋白失活或者缺失时，由于密集分布的反转录转座子替代着丝粒组蛋白的功能协助染色体正确分离[9-10]，二者间相互作用确保了染色体正确分离，由此可见，着丝粒DNA序列在指导染色体正确分离的过程中有着重要作用，着丝粒DNA序列虽然功能上高度保守，但在序列组成水平上却高度不保守，这也成为着丝粒研究中的一个未解之谜[11]。

本研究应用荧光原位杂交（FISH）和基因组原位杂交（GISH）检测K型不育系YM3、YN1、YJ3、K-Salmon及其保持系的染色体组成，分析不同材料中染色体组成的差异；其次将K型不育系及其保持系配制杂交组合，应用FISH、GISH技术检测后代的染色体组成，探讨不同细胞质中1BL/1RS易位染色体和后代产生单倍体的相关性；最后将K-Salmon分别和中国春、H4104配制杂交组合，进一步分析K-Salmon的杂交后代中高频率产生单倍体的机制，为进一步探讨着丝粒反转录转座子在染色体正确分离和稳定遗传中的作用机制提供理论支持。

1 材料和方法

1.1 试验材料

试验材料为小麦K型不育系YM3、YN1、YJ3、K-Salmon及其保持系和中国春、H4104易位系，均由中国科学院遗传研究所韩方普教授提供。

1.2 试验方法

试验于2017—2019年先后在中国科学院遗传研究所和山西省农业科学院生物技术研究中心进行。

1.2.1 中期染色体的制备 根尖细胞中期染色体的制备、探针标记方法以及原位杂交程序均按照HAN等[12]描述的方法进行。首先，每份材料中分别选取约20粒种子，将挑选好的籽粒饱满的种子在垫有湿滤纸的培养皿中发芽，待根长长到2～3 cm时，剪取生长旺盛的根尖，用果胶酶和纤维素酶的混合溶液37℃消化50 min，然后用70%的酒精洗2次，捣碎，离心，100%的乙酸溶解，滴片。

1.2.2 原位杂交技术 植物总DNA的提取采用CTAB法[13]，利用微量紫外分光光度计检测样品DNA浓度，并统一稀释至终浓度为100 ng/μL。

原位杂交程序按照HAN等[12]描述的方法进行，在GISH分析中，提取中间偃麦草的基因组DNA，用fluorescein-12-dUTP标记为绿色，小麦的着丝粒逆转录转座子用Texas red-5-dCTP标记为红色，用中国春基因组DNA作为封阻；在FISH分析中，pAs1探针的信号标记为红色，pAWRC.1探针的信号标记为绿色。细胞学镜检采用OLYMPUSBX60荧光显微镜观察，用Photo-metrics SenSys CCD成像。

2 结果与分析

2.1 细胞学筛查K型不育系材料的染色体组成分析

在育种实践中，将普通小麦的细胞核导入粘果山羊草（Aegilops caudata）的细胞质中，获得K型细胞质雄性不育系，在利用K型不育系配制杂交种时，检测到后代有频率不等的单倍体产生，因而，严重制约K型雄性不育系在生产中广泛应用。为此，本试验检测K型不育系的染色体组成发现，虽然K型细胞质能使普通小麦Salmon出现高达80%的单倍体，但后代的农艺特征无明显的负作用[2]，这是迄今为止任何单倍体育种技术都难以比拟的。而且这样诱导的单倍体种子，一般均能正常发芽，生长发育良好，加倍方便[14]。为此，本试验深入研究不同K型不育系的染色体组成及着丝粒的特点。首先，采用GISH和顺序FISH的方法检测不同K型不育系的染色体组成。以重复序列pAs1和黑麦基因组DNA为探针进行GISH、FISH分析（图1）。

在12份材料中检测到只有YM3和YM3B不含1BL/1RS易位染色体，其余所有材料均含有1BL/1RS易位染色体，同时应用重复序列pAs1和黑麦重复序列为探针进行FISH分析，结果表明，1BL/1RS易位染色体的着丝粒区域出现2个信号，小麦和黑麦着丝粒DNA序列的信号均被检测到，检测结果和前期关于1BL/1RS易位染色体着丝粒的组成和结构特点一致[15-16]，1BL/1RS易位染色体进入粘果山羊草的细胞质后，染色体组成未发生改变。对比几个K型不育系材料的染色体组成可以发现，按是否含有1BL/1RS易位染色体将K型不育系分为含有1BL/1RS易位染色体的K型不育系和不含有1BL/1RS易位染色体的K型不育系；在育种实践中研究发现，含有1BL/1RS易位染色体的K型不育系杂交后代会出现一定比例的单倍体，而不含有1BL/1RS易位染色体的K型不育系的杂交后代几乎不产生单倍体。因此，1BL/1RS易位染色体可能在K型不育系诱导单倍体产生的过程中起了重要的作用。

2.2 细胞学筛查K型不育系杂交后代的染色体组成分析

在小麦单倍体育种研究中，通过对单倍体的诱导和加倍，植株快速纯合，有效缩短育种周期，提高育种效率，是小麦育种中快速有效的方法之一。然而，在育种实践中，无论体内诱导还是离体培养，获得单倍体的诱导率和加倍率均不足10%，严重制约小麦单倍体育种在实践中的应用价值。在创制杂种小麦的育种实践中，将小麦的细胞核导入粘果山羊草的细胞质后，意外发现后代产生频率不等的单倍体，有的K型不育系单倍体频率甚至达到80%[4]。为了进一步研究K型不育系和保持系杂交后代的染色体组成，本研究配制了6种杂交组合，每个杂交组合的后代检测35粒左右，采用GISH和顺序FISH的方法检测这6种杂交组合后代的染色体组成。后代染色体组成情况如表1所示。

表1 K型不育系不同杂交组合的后代染色体组成%

由表1可知，YM3和YM3B的杂交组合不产生单倍体和双生苗，可以在杂交小麦选育中广泛应用。YN1、YN1B和YJ3、YJ3B杂交组合产生一定比例的单倍体后代，但是未发现有双生苗的情况。而K-Salmon和Salmon的杂交组合中，后代不仅有正常的整数倍体和单倍体，还发现有双生苗的情况，而且比例较高。于是，本研究进一步配制杂交组合K-Salmon和H4104（含有1BL/1RS易位染色体）、中国春的杂交组合，检测后代的染色体组成。结果表明，杂交后代中出现相似比例的单倍体和双生苗，并进一步检测单倍体和双生苗中1BL/1RS易位染色体着丝粒的组成特点，如图2所示，单倍体和双生苗中的1BL/1RS易位染色体着丝粒组成和小麦细胞质中的1BL/1RS易位染色体的融合着丝粒一致（图2），小麦着丝粒DNA和黑麦着丝粒DNA均被检测到。

3 结论与讨论

在育种实践中，将普通小麦的细胞核导入粘果山羊草的细胞质中，获得的细胞质雄性不育系在杂交小麦的育种中起重要作用。然而，在利用K型不育系配制杂交种时，因后代出现比例不等的单倍体制约K型雄性不育系在生产中的广泛应用。随后的研究发现，虽然K型细胞质能使普通小麦出现较高比例的单倍体，但后代的农艺特征无明显的负作用[2]，这是迄今为止任何单倍体育种技术都难以比拟的，而且这样诱导的单倍体种子，一般均能正常发芽，生长发育良好，加倍方便[14]。1BL/1RS易位系是小麦育种中应用最多、最成功的易位系，将黑麦1RS染色体片段携带的抗白粉病、锈病等多种病害及丰产、广适性等优良性状的基因转移到小麦中。在前期的研究中发现，1BL/1RS易位染色体在六倍体小麦背景中能稳定遗传[15-16]，通过对山西省农业科学院生物技术研究中心小麦课题组收集的近110份含1BL/1RS易位染色体的小麦材料，发现在不同细胞质中易位染色体的融合着丝粒均由小麦着丝粒组蛋白H3负责招募小麦和黑麦的部分着丝粒DNA序列[15]。为了深入分析K型不育系中1BL/1RS易位染色体在杂交后代中的作用机制，本研究筛查了10份K型不育系及其后代的染色体组成情况，发现不含1BL/1RS易位染色体的K型不育系和保持系杂交后代中没有单倍体子代，而含有1BL/1RS易位染色体的K型不育系和保持系杂交后代中出现一定比例的单倍体，特别是一种含有1BL/1RS易位染色体的K-Salmon不育系和保持系杂交后代中出现更高比例的单倍体，同时还有一定比例的双生苗，并应用FISH和GISH检测发现，1BL/1RS易位染色体无论在单倍体还是双生苗中，染色体和着丝粒的组成没有发生改变，由此可见，1BL/1RS易位染色体的着丝粒在K型不育系诱导单倍体的过程中起重要的作用。研究1BL/1RS易位染色体和K型细胞质的互作遗传效应高比例诱导小麦单倍体的机制，可以进一步拓展异源细胞质诱导小麦单倍体技术在小麦育种实践中的应用价值。

研究发现，着丝粒和特异性的蛋白结合成动粒，在细胞分裂过程中成为纺锤丝牵引附着的主要位点[5]。着丝粒组蛋白H3与典型组蛋白H3结构不同，它是较早发现的功能着丝粒的核心蛋白，其N末端在长度和氨基酸组成方面变异程度较高[17-20]。着丝粒组蛋白H3不仅能导致细胞有丝分裂紊乱，还和外源染色体在寄主基因组中的去留有联系[15]。着丝粒DNA序列是植物甚至真核生物进化最快的序列之一，即便在亲源关系非常近的物种中，着丝粒的DNA序列长度或组成可能完全不同。通过对着丝粒序列的分析，初步认为着丝粒序列结构主要由重复序列和反转录转座子组成，反转录转座子的扩增和插入又会产生新的重复序列[21]。相比卫星重复序列，反转录转座子更保守一些，如：Ty3-gypsy是着丝粒专一的反转录转座子家族[22]，着丝粒反转录转座子能够定位包含着丝粒组蛋白H3的核小体的分布方式[23]，甚至在CenH3失活或者缺失时，染色体依然能正常分离[24]，推测着丝粒反转录转座子起主要作用，这种推测在随后关于Holocentricity的研究中得到证实，在动物和植物中都发现部分物种中着丝粒缺失着丝粒组蛋白H3，由于密集分布的反转录转座子替代着丝粒组蛋白H3的功能协助染色体正确分离。在小麦中，基因克隆和定位研究发现，CenH3基因位于第一同源群[25]，1BL/1RS易位染色体的着丝粒由小麦和黑麦的部分着丝粒DNA序列构成[16，26]，易位染色体在普通小麦中能正确分离、稳定遗传，但是，在K型细胞质中却高频诱导产生单倍体。因此，研究着丝粒序列协同着丝粒组蛋白H3指导1BL/1RS易位染色体在K型细胞质中分离，探究其作用方式为揭示异源细胞质诱导产生单倍体的机制提供理论支持。本研究应用FISH和GISH技术，筛查6个杂交组合的亲本及其后代的染色体组成规律，研究发现，所有检测样品中易位染色体均为融合着丝粒；筛查配制的杂交组合后代单倍体率，发现只有含有1BL/1RS易位染色体的K型不育系才产生单倍体，特别是K-Salmon不育系无论和保持系还是其他含有1BL/1RS易位染色体的小麦杂交，都产生比例很高的单倍体，包括和中国春杂交，单倍体率也很高，但是本研究各种杂交组合的单倍体率没有筛查到80%以上的情况，推测可能是研究中采用的不育系材料为高代材料，在不断的保种过程中1BL/1RS易位染色体的着丝粒DNA序列和K型细胞质逐渐共存协同作用指导易位染色体分离。

然而，由于着丝粒结构特殊，指导染色体的分离不仅和着丝粒组蛋白H3有关，还和着丝粒DNA有密切关系，着丝粒区域的DNA序列组成及其功能的解析至今依然是研究难点之一[24]。1BL/1RS易位染色体在小麦背景中能稳定遗传，但是异质到K型细胞质后产生比例不等的单倍体，由此可见，黑麦的部分染色体片数和K型细胞质的互作是后代产生高比例单倍体和双生苗的重要原因，但是黑麦染色体片断以及着丝粒DNA序列的组成等方面是否发生变化还需要结合CHIP等技术做进一步的遗传和表观遗传学研究。其次，在一些模式植物的研究中发现，由于父本着丝粒组蛋白H3在合子中失活而逐渐丢失产生单倍体后代，然而关于着丝粒DNA何时参与或者取代着丝粒组蛋白H3指导染色体分离的研究却很少[27]。因此，今后对易位染色体着丝粒DNA序列做进一步遗传和表观遗传分析，将有助于理解着丝粒DNA序列指导染色体分离的机制。