哺乳动物获能精子蛋白酪氨酸磷酸化研究进展

胡启蒙，何 群，何建云，李蒙玉，杨宇新

(廊坊师范学院生命科学学院 河北省动物多样性重点实验室，河北 廊坊 065000)

人类和动物不育症是世界性问题，其原因复杂，其中雄性不育所引起的约占40%[1]。传统方法检测或预测精卵受精功能已不能满足现阶段的研究需求，需要更加精准的检测，深入分子层面了解精子获能及受精作用的机制，为解决哺乳动物不孕不育作出判断。

精子是一种高度分化的生殖细胞，其功能发挥是通过多种信号通路调节完成的，信号通路的主要调控方式之一就是酪氨酸磷酸化调节[2]。精子蛋白通过酪氨酸磷酸化转录后修饰，保证精子受精完成的相关生理活动顺利进行，其中包括精子活力、超激活运动(化学趋向性)、获能、顶体反应以及精子和透明带结合，这些功能都受到蛋白质酪氨酸磷酸化的精准调控，保证精子功能的正常发挥[3]。精子蛋白酪氨酸磷酸化过程受体内和体外多种因素的影响，如精子所在内环境的pH、体外环境等。

1 精子获能

1951年是精子生物学领域关键的一年，Austin(1951)和Change(1951)通过独立研究大鼠(Rat)[4]和兔(Rabbit)[5]发现，排卵期悬浮于输卵管中的精子无受精能力，但是如果存在于排卵期前几小时的输卵管中的精子则具有受精能力。后又进一步研究了精子受精的生理机制，1952年Austin首次使用了“capacitation”，译为“获能”来描述精子需要经历具有时间依赖性的生理变化从而获得受精能力。获能过程具有物种特异性，有的物种完成获能所用时间短，有的物种则耗时长。精子获能过程中头部发生顶体反应，精子质膜与卵子的透明带相融合，此时精子尾部具有超激活运动的能力，可穿越雌性生殖道输卵管，穿透卵子透明带[6]。

从精子获能的发现至今已经历60年的时间，目前已经发现激发和支持精子获能所必需的成分，其中包括HCO3-、Ca2+以及血清白蛋白等[7]，通过体外培养，获得具有受精能力的精子。将体外获能培养的精子作为研究对象，可进一步了解精子受精能力的分子机理。

2 酪氨酸磷酸化与精子获能

磷酸化是一种常见的翻译后修饰作用，通过添加或去除酪氨酸、苏氨酸或丝氨酸基团，引起蛋白的活化或失活[3]。磷酸化不仅存在于真核细胞内，也适用于原核细胞及细菌[8]。蛋白磷酸化可引起其结构的变化，在细胞各功能中起极其重要的作用，如细胞增殖、分化、细胞骨架重组、细胞凋亡及离子瞬间调控等。蛋白质磷酸化在精子生理中也具有极其重要意义。

2.1 酪氨酸磷酸化与精子活力

精子向卵子有方向性的运动能力被称为精子活力。精子活力是保证精卵受精成功的条件之一。精子运动能力弱或不动的精子都不具备正常的生理功能。超激活运动是一种剧烈的精子运动模式，通过大幅度增加精子鞭毛不对称摆动，从而提供精子穿越卵子透明带顺利与卵子结合的动力。超激活运动被视为精子获能标志，精子发生获能过程极为复杂，获能生理过程的调控信号通路，几乎都涉及到蛋白酪氨酸磷酸化。Yanagimachi[9]研究发现附睾中的精子不能发生受精反应，原因是其相关蛋白还未完成酪氨酸磷酸化反应。精子在附睾中成熟后，通过射精作用，进入雌性生殖道内，受精作用前，精子的相关蛋白发生酪氨酸磷酸化调控获能信号通路，完成获能反应，从而获得受精能力，顺利完成与卵子的结合。Visconti及其同事[10-11]研究证实蛋白质酪氨酸磷酸化过程与获能和顶体反应密切相关；有研究人员也发现了酪氨酸磷酸化与精卵结合的关系。通过研究精子酪氨酸磷酸化反应，了解精子受精能力的分子机制[12]。

目前有20多种蛋白与精子鞭毛纤维有关，人精子中存在有A型激酶锚定蛋白(A-kinase-anchoring proteins,AKAPs)和钙结合酪氨酸磷酸化调节蛋白(Calcium-bingeing tyrosine phosphorylation-regulated protein,CABYR)，这些蛋白结合于精子鞭毛主段的纤维鞘上，可影响精子运动，此过程由蛋白激酶A(Protein kinase A，PKA)调控[12]，PKA抑制剂可有效的阻止精子发生超激活运动[13]。

肌动蛋白聚合是精子获能过程中重要的环节，对精子运动有促进作用。它是一个时间依赖性过程，从尾部开始，沿续至头部。肌动蛋白聚合对精子运动有促进作用，肌动蛋白解体对顶体反应有促进作用。肌动蛋白的聚合由酪氨酸磷酸化控制，当酪氨酸磷酸化过程被抑制，肌动蛋白的聚合作用也被抑制，从而获能反应受到影响[14]。

2.2 酪氨酸磷酸化与顶体反应

只有发生了获能反应的精子才能激发顶体反应，顶体反应可以保证精子与卵子顺利结合[15]。与顶体反应有关的蛋白酪氨酸磷酸化种类已有研究，小鼠精子中Acrosin binding protein位于顶体上，获能期间发生酪氨酸磷酸化，参与精子顶体反应和透明带融合[16]。

3 酪氨酸磷酸化与精子能量代谢

能量代谢是支持精子功能的重要条件。哺乳动物精子细胞内能量的来源是ATP，ATP为精子运动、蛋白质调控以及受精作用提供能量。精子相对于体细胞需要更多的ATP，不只是维持精子的运动，还因为需要调控获能期间蛋白质磷酸化[17]。获能精子磷酸戊糖途径有两种关键酶，一种是葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(Glucose-6-phosphate dehydrogenase，G6PD)和6-磷酸葡萄糖磷酸脱氢酶(6-phosphogluconate dehydrogenase，6PGD)，在体外培养环境中，提高cAMP的存在量以及蛋白酪氨酸磷酸化程度增加，均使这两种酶活性提高。

糖酵解或氧化磷酸化过程是ATP的直接来源，这两个途径虽独立存在发挥作用，但也相互协调共同为精子提供所需要的能量[18]。根据不同的物种特异性，精子获取能量所依赖这两种途径的程度有所不同。

4 酪氨酸磷酸化信号通路

目前已知的调控精子蛋白酪氨酸磷酸化的通路是cAMP-PKA信号通路。细胞内的cAMP浓度由腺苷酸环化酶(adenylyl cyclases，ACs)控制，哺乳动物体内含有两种类型的ACs，一种是tmACs(transmembrane AC enzymes)，另一种为sAC(soluble AC)。可溶性腺苷酸环化酶可直接被HCO3-调控，精子获能期间，质膜发生胆固醇外流，HCO3-和Ca2+通过膜上离子通道进入细胞内激活sAC，sAC水解ATP生成cAMP，cAMP可作为第二信使激活PKA[19]。试验还证实其他信号通路如磷脂酰肌醇-3-羟激酶(PI3K)信号通路[20]、分裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路[21]和环磷酸鸟苷(cGMP)信号通路等可间接调控精子蛋白酪氨酸磷酸化水平[22]。

5 酪氨酸磷酸化影响因素

5.1 体内因素

5.1.1 Ca2+钙离子对精子蛋白磷酸化具有重要的调控作用，是精子功能完成的重要保证[23]。试验证明精子细胞中Ca2+在调节精子运动和蛋白质磷酸化方面具有双重功能。低浓度钙离子可以促进精子运动和蛋白磷酸化程度，但钙离子浓度较高时则会抑制精子运动能力[23]。钙离子通过调节cAMP和ATP的含量来调节精子运动和蛋白磷酸化程度。其信号通路包括cAMP/PKA和Ca2+/CaM/CaMK[23]。

5.1.2 pH、HCO3-和BSA 获能后精子才具有受精能力，获能是受精的关键，Ca2+、HCO3-和BSA是精子体外获能培养液的主要成分，是探究精子获能的重点，也是调控酪氨酸磷酸化的重要影响因素[24]。精子获能所依赖的一系列分子事件与雌性生殖道内环境有关。研究表明，雌性生殖道含有高浓度的HCO3-，其对精子运动、精子获能、超激活运动以及顶体反应起重要的调节作用。HCO3-是细胞内的主要缓冲离子。在获能过程中能通过非pH依赖性的方式直接刺激sAC，另外，其作用受PKA的调控，HCO3-浓度升高后，激活sAC，从而改变cAMP的浓度，而sAC是精子蛋白质发生酪氨酸磷酸化必需的[13]。BSA可通过调节精子质膜上的Ca2+通道，诱发细胞外Ca2+进入细胞内，激活cAMP/PKA依赖性信号系统并促进蛋白质的酪氨酸磷酸化，最终使精子获能[25]。

5.1.3 ROS 人类不育是影响人类健康的一个重大问题，男性不育病因复杂，其临床表现为低精、绝精或精子无生理功能。不能生成正常功能精子的原因可能是精索静脉曲张、隐睾症、营养不良、感染或创伤，也可能是生活环境污染、化学治疗、吸烟或疾病。值得注意的是，所有上述条件的氧化应激是作为其病理生理机制的重要组成部分[26]。

体内的活化氧ROS氧化应激反应是由于生理过程中产生活性氧或者是抗氧化能力减弱(或两者均存在)[26]，其作用于所有细胞成分。体内氧化应激反应对精子获能以及精子蛋白酪氨酸磷酸化作用是双重的。低浓度ROS触发获能事件，如活化腺苷酸活化酶、增加细胞内Ca2+浓度和磷酸化过程，最终蛋白质发生酪氨酸磷酸化。当精子所处环境氧化应激反应过强时，精膜抗氧化酶水平低，精子的运动能力减弱、线粒体的活性降低[27]，甚至造成DNA破碎。其中30%～80%男性不育的原因是由于活性氧引起的精子损伤[28]。在体外获能培养精子条件下，添加活性氧成分，精子酪氨酸磷酸化程度以及顶体反应与未获能精子相似[29]。

5.2 外界作用

5.2.1 细菌污染 研究报道细菌会影响猪精子质量，例如获能的指标(精子活力下降，质膜的排列紊乱，精子存活率降低以及磷酸化程度变化)下降。当猪精子中绿脓杆菌的浓度高于106CFU/mL时，可显著影响精子脂膜重新排列的程度，从而造成精卵融合速度降低，精子运动能力减弱，呈现较为典型的“似获能”状态，磷酸化程度也受到相应的影响。研究发现，猪精液存在大肠杆菌、阴沟肠杆菌、产气荚膜梭菌、绿脓杆菌[30]。人工精子采集过程中，无法达到无菌状态，精液会受到细菌的侵染。正常射精过程中，精液中也会存在一系列的微生物，严重的情况下会影响精子功能和质量，从而导致不育。

5.2.2 其他 BisphenolA (BPA) 是一种广泛存在于环境中的污染物，会影响人类及其他哺乳动物。其主要来源于食物包装、工业原料、牙齿填充物等。BPA具有毒性以及环境残留强的特性，目前受到公众健康研究的重视。BPA作为激素扰乱剂，可抑制雄性激素、甲状腺激素生成。BPA暴露的方式主要是人类及动物摄取受到BPA污染的食物，同时还可通过真皮吸收和呼吸途径作用[31]。

氟化钠是一种环境污染物，实验室环境下发现其对动物具有雄性不育作用。近40多年，越来越多环境污染物中含有氟，其中氟化钠的存在对于临床和实验动物具有生理毒性，抑制细胞内ATP和Ca2+的含量，对PKA活性也有影响，从而造成蛋白酪氨酸磷酸化的降低，影响正常雄性生殖功能[32]。

大黄素是中国传统中药成分，对小鼠精子功能具有一定影响，可抑制钙离子的生成，降低蛋白质酪氨酸磷酸化[33]。

环境毒物铬(Cr，六价)减少精子活力，降低蛋白酪氨酸磷酸化程度。高浓度的Cr降低体外培养的猪精子活力。Cr影响线粒体活性，减少ATP的产生，从而降低精子中段蛋白酪氨酸磷酸化的含量。Cr通过cAMP/PKA通路影响活力和蛋白酪氨酸磷酸化[34]。

6 展 望

哺乳动物精子是一种高度分化的特异性生殖细胞，随着蛋白质组学等科学技术的发展，精子生理学得到了发展，特别是获能精子生理研究进入新阶段。在临床治疗男性不育方面，通过阻断获能过程中关键酶控，阻止精子受精所研制出的男性避孕药，减少意外怀孕风险, 增加女性健康关爱的力度。在经济型家畜生产中，针对解冻后精子受精能力下降，找到合适的外界培养条件，减少低温及氧化对精子的刺激，提高解冻后精子的受精能力。

但获能精子蛋白酪氨酸磷酸化调控信号通路以及与代谢途径的关系还未完全了解，其中酪氨酸磷酸化蛋白在获能期间具体功能还需要后续研究。(1)深入研究哺乳动物获能精子中酪氨酸磷酸化蛋白在能量代谢途径中的具体功能，可以进一步了解氧化磷酸化途径和糖酵解途径在精子获能中的作用。(2)精子蛋白酪氨酸磷酸化具有时间依赖性，可动态研究获能精子酪氨酸磷酸化过程。(3)借助基因剔除动物的辅助实验，了解复杂的酪氨酸磷酸化调控网络，感谢实验动物对科学所作出的贡献。