磺胺二甲嘧啶及其加入方式对猪粪厌氧消化的影响

钟 珊 , 王小庆 ,马保华, 邹永德 , 廖新俤, 杨江鸿, 吴银宝，2*

(1. 华南农业大学 动物科学学院，广东 广州 510642；2. 华南农业大学 农业部华南热带农业环境重点实验室，广东 广州 510642；3. 南海出入境检验检疫局，广东 佛山 528200)

磺胺类兽用抗生素在畜禽养殖中常作为饲料添加剂用以预防疾病和促生长，但由此也导致畜禽粪尿中磺胺类兽用抗生素残留。在上海市多个养殖场采集到的粪便和土壤中，磺胺二甲嘧啶(SMZ)的检出浓度范围为1.29～8.01 mg/kg[1]。Pan等[2]在猪粪中也检测到SMZ的浓度为28.7 mg/kg。由于兽用抗生素普遍具有广谱抗菌性，其随畜禽粪污进入厌氧消化系统就会影响厌氧消化系统的功能，同时还需要关注兽用抗生素的降解产物在厌氧消化系统中的残留[3-4]。N4-ACE-SM2是SMZ在动物体内的主要代谢产物，它可以与SMZ一同随动物的粪尿排泄到环境中，对环境造成潜在的威胁[5]。目前对于兽用抗生素对猪粪厌氧消化的影响研究多采用直接加入法[6-9]。已有研究表明，对于泰乐菌素和金霉素，在相同试验条件下，体内代谢法和直接加入法所得结果不同[10-11]。对于SMZ是否也存在类似结果，目前尚未有相关研究。由此，本研究经体内代谢法和直接加入法研究了SMZ对猪粪厌氧消化系统的影响，可为评价兽用抗生素对厌氧消化系统的影响及其生态毒理学效应提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

SMZ原料药购自华南农业大学华天兽药厂，SMZ标准品购自中国标准物质网。随机选取30头33 kg左右的长大二元杂母猪，预饲期为2周，日粮中不添加任何兽药，临床无异常后进入正式试验期。正式试验分为空白组和试验组，每组15头。空白组所饲喂饲料中不添加任何兽用抗生素；试验组在饲料中添加SMZ，添加量为200 mg/kg饲料，首次量加倍，用药期为7 d。收集用药期内空白组和试验组的猪粪，经检测SMZ浓度和其代谢产物N4-ACE-SM2浓度后用于厌氧消化试验。选取含SMZ最高和最低的猪粪用于厌氧消化试验，以反应生产实践中SMZ在猪粪中的平均残留水平。

1.2 试验装置

模型厌氧消化系统为有效容积1 300 mL的三口玻璃烧瓶[12]，三个出口均采用橡胶塞封严，顶部橡胶塞钻出输气孔与吸收瓶相连，侧边出口分别用于取发酵液样和加入新鲜猪粪样。吸收瓶和集液瓶采用500 mL广口瓶，吸收瓶用橡胶塞封口。吸收瓶橡胶塞上钻孔连接玻璃和橡胶管路，用于导出厌氧消化所产生的气体及吸收瓶中的液体。

1.3 试验设计

厌氧消化试验设4个试验组和1个对照组，每组3个重复。试验组依据两种加入方式和两种加入浓度分为4个处理组，两种加入方式分别为经体内代谢组(即在饲料中添加SMZ经体内代谢后所收集的含SMZ和N4-ACE-SM2的猪粪)和直接加入组(即加入空白猪粪和相应浓度SMZ)，两种加入浓度分别为56.04 mg/kg 干猪粪(所获猪粪中SMZ最高浓度)和47.10 mg/kg干猪粪(所获猪粪中SMZ最低浓度)。经检测其代谢产物N4-ACE-SM2浓度分别为29.20 mg/kg 和17.80 mg/kg。试验分组如表1所示。厌氧消化温度设定为30 ℃。

正式厌氧消化试验开始前，先在模型厌氧消化系统中加入固体率为10%的猪粪污水900 mL，接种100 mL成熟沼液，系统中剩余空间用氮气填满。待厌氧消化系统产气稳定后，开始进行正式试验。

正式试验时间为28 d，其中前7 d为加药期，后21 d为停药期，直至系统中检测不出兽药原形及其主要代谢产物残留时停止试验。每天8:00先从系统中取出100 mL混匀的沼液，然后CK组试验全期每天均加入100 mL固体率为10%的空白猪粪污水；A1～B2组加药期分别加入100 mL固体率为10%的含SMZ的猪粪污水，停药期加入100 mL固体率为10%的空白猪粪污水。试验期内系统沼液总体积保持不变。

1.4 指标测定

1.4.1 SMZ和N4-ACE-SM2浓度 取10 mL沼液沼渣混合物，加入10 mL 0.01 mol/L Na2EDTA的Mcl-Vaine液，漩涡混合30s，超声10 min，4 ℃ 13 000 r/min离心10 min，上清液倒入另一干净离心管中，沉淀中加入5 mL提取液，重复上述步骤再次提取，混合两次上清液，4 ℃ 13 000 r/min的速度离心5 min，取上清液过固相萃取小柱。固相萃取小柱先用1 mL甲醇激活，1 mL水平衡，然后将上清液过柱，使药物吸附在萃取小柱上，加水3 mL清洗小柱，顶空1 min，然用0.5 mL甲醇和0.5 mL 2%甲酸甲醇溶液洗脱。洗脱液用0.22 μm滤膜过滤后，用于高效液相色谱仪检测。

SMZ色谱条件：紫外检测器，检测波长275 nm；色谱柱采用Kromasil C18 柱(250 mm × 4.6 mm，5 μm，100 A)；柱温30 ℃；进样量20 μL；流动相为乙腈：5%冰醋酸(12:88)；流速1.0 mL/min；检测限0.1 μg/mL；回收率75%。在上述检测条件下，能将沼液沼渣中SMZ与其它物质分开，其保留时间为15.250 min。

N4-ACE-SM2色谱条件：紫外检测器，检测波长262 nm；色谱柱采用Kromasil C18 柱(250 mm×4.6 mm，5 μm，100 A)；柱温30 ℃；进样量20 μL；流动相，乙腈：0.5M磷酸氢二钾=15：85；流速1.0 mL/min；检测限0.1 μg/mL；回收率72%。在上述检测条件下，能将沼液沼渣中N4-ACE-SM2与其它物质分开，其保留时间为8.957 min。

1.4.2 产甲烷量 采用排水法计算甲烷产量[13]。

1.4.3 产甲烷菌多样性 采用OMEGA 公司E.Z.N.A. Soil DNA Kit 试剂盒提取沼液沼渣中细菌基因组DNA，对其进行16S rDNA PCR扩增。引物对为：A934F 5'-AGG AAT TGG CGG GGG AGC A-3'和1390r 5'-ACG GGC GGT GTG TCA A-3')，其中在1390r的5'端加入33个GC夹(5'-CGC CCG GGG CGC GCC CCG GGC GGG GGC GGG GGC ACG GGC GGT GTG TCA A-3')，以增加产物的稳定和片段的分离。所得PCR产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定并照像。采用BIO-RAD DCodeTM Universal Mutation Detection System(基因突变检测系统)对细菌PCR产物进行变性梯度凝胶电泳(Denaturing Gradient Gel Electrophoresis，DGGE)分析。使用Quantity One软件分析DGGE图谱，并计算Shannon's多样性指数H＇，计算公式为：

式中：H＇为Shannon's多样性指数，H＇值越大说明样品的多样性程度越高；s为每个泳道条带数；Pi为每个条带强度占总条带强度的比例。

利用Phroetix-1D(Totallb)和Phroetix-1D Pro(Totallb)软件对DGGE电泳图谱进行相似性分析，得到各个泳道间的相似性指数，即戴斯系数(Dice Coefficient，Cs)，根据Cs得到各个泳道相似性系数矩阵图，用非加权组平均法(Unweighted Pair Group Mean Average，UPGMA)将相似性系数矩阵转化为相似性聚类树状图，然后对聚类树状图进行分析。在聚类树状图中的Distance表示泳道间条带差异性，当Distance为0时表示差异性为0，泳道间的条带完全相同，当Distance为1时则相反，表示差异性为1，泳道间的条带完全不同。

1.5 数据处理

数据统计结果用平均数±标准误表示，采用SPSS 13.0软件进行统计分析，多重比较采用邓肯极差检验法，显著水平P值设为0.05，P<0.05表示差异显著，P>0.05表示差异不显著。

2 结果与分析

2.1 SMZ及N4-ACE-SM2浓度在厌氧消化系统中的变化规律

由表2可知，随着含SMZ猪粪的加入，厌氧消化系统中SMZ浓度一直呈上升趋势，这可能使由于厌氧消化系统对其的降解量小于系统中SMZ的加入量。7 d加药期结束时，除CK组未检出SMZ外，A1、B1、A2和B2组系统中SMZ的浓度分别为0.91、0.81、0.72、0.73 mg/L。进入停药期后，系统中SMZ浓度快速下降，在停药期第4天(试验第11天)时，各试验组SMZ浓度已经降至加药期结束时浓度的50%左右，但之后SMZ降解速度变缓，直至停药期第21天(试验第28天)时，各试验组才检测不出SMZ残留，由于本研究采用动态进出样，不断有SMZ随沼液沼渣排出到系统外，SMZ在系统中也被逐步降解，浓度下降。各试验组系统中SMZ浓度差异不显著(P>0.05)，且变化趋势相同。

表2 厌氧消化系统中SMZ与N4-ACE-SM2的浓度变化Table 2 The concentration of SMZ and N4-ACE-SM2 in anaerobic digestion system mg/L

SMZ在猪体内的主要代谢产物为N4-ACE-SM2[5]，本研究测定了各试验组厌氧消化系统中N4-ACE-SM2的浓度。由表2可知，在加药期系统中N4-ACE-SM2浓度呈上升趋势，这表明随着含SMZ猪粪的加入，系统中N4-ACE-SM2浓度也逐步累积。进入停药期后，厌氧消化系统中的N4-ACE-SM2浓度逐步下降，在试验第25天，各试验组厌氧消化系统中均未检出N4-ACE-SM2残留。B1组和B2组所用空白猪粪中不含N4-ACE-SM2，但系统中同样检测到该物质，表明N4-ACE-SM2不仅可以经体内代谢产生，而且也可在厌氧消化系统中分解产生。方差分析表明，不论在加药期、停药期还是在整个试验期，N4-ACE-SM2的浓度在各试验组间差异不显著(P>0.05)，浓度变化趋势也相似。

2.2 SMZ对厌氧消化系统产甲烷量的影响

由表3可见，在试验浓度条件下，加药期A1、B1、A2和B2组分别与CK相比，系统产甲烷量无显著差异(P>0.05)。但采用经体内代谢法的A1组和A2组产甲烷量分别比同浓度的直接加入法的B1组和B2组显著降低了17.36%和23.60%(P<0.05)。说明加药期经体内代谢法抑制了产甲烷量。停药期B1组和B2组产甲烷量显著低于CK组、A1组和A2组(P<0.05)，B1组和B2组产甲烷量比A1组和A2组显著降低了13.79%和16.34%。这说明停药期直接加入法抑制了产甲烷量。

表3 SMZ对厌氧消化系统产甲烷量的影响Table 3 Effect of SMZ on the methane volume of anaerobic digestion system mL/d

注：同列肩注无相同字母者表示差异显著(P<0.05)，有相同字母表示差异不显著(P>0.05)。

Note：In the same column, values with the different letter superscripts mean significant difference(P<0.05), same letter superscripts mean insignificant difference(P>0.05).

2.3 SMZ对厌氧消化中产甲烷菌多样性的影响

2.3.1 产甲烷菌16SrDNA PCR扩增结果 分别在试验第0、4、8、28天，采集5个试验组沼液沼渣混合样品提取微生物总DNA，并利用产甲烷菌的通用引物进行16S rDNA PCR扩增，扩增所得电泳图如图1所示。由图1可知，所得PCR产物的分子量约为500 bp，片段大小与引物所能扩增的产物大小一致，初步鉴定是本试验所需的目的片段。

2.3.2 产甲烷菌多样性变化的DGGE分析 对所得PCR扩增产物进行DGGE分析可得图2。图2每个泳道中条带数代表产甲烷菌的丰富度，每条带明暗程度代表其所占比例大小。由图2可知，在整个试验过程中，产甲烷菌条带数差异较小，但同一位置同种菌群在不同时期含量不同。

对DGGE图谱分析并计算Shannon's多样性指数H＇，从而对试验开始时(第0天)、加药期间(第4天)、加药期结束时(第8天)和试验结束时(第28天)的样品进行产甲烷菌多样性的对比。SMZ对厌氧消化系统产甲烷菌多样性指数H＇的影响如表4所示。第0天和第8天，各组间产甲烷古菌H＇变化无显著差异(P>0.05)；在第4天和第28天，各试验组的产甲烷菌H＇与CK组无显著差异(P>0.05)，但加药期第4天采用直接加入法的B1和B2组H＇显著高于经体内代谢法的A1和A2组(P<0.05)；在试验期结束时，B1和B2组H＇显著低于CK组、A1组和A2组(P<0.05)。

选取图2所示DGGE图谱中标注的1-4条带进行回收测序，将序列与Genbank进行比对，找到与其相似性最高的菌株，可得结果如表5所示。结果表明，试验第4天，B2组出现条带3(methanobacterium，产甲烷杆菌)，同时B1和B2组条带1(uncultureal methnogenic，未培养的产甲烷古菌)较其它试验组亮，说明此时直接加入法的B1和B2组系统中出现产甲烷杆菌以及未培养的产甲烷古菌数量增加，这可能解释了加药期直接加入组产甲烷菌多样性指数H＇和产甲烷量均显著高于经体内代谢组的原因。第8天时，仅在CK组中出现条带4(methanobrevibacter sp，产甲烷短杆菌)，并且除CK组和A1组外，其余试验组中均未出现条带1。在试验结束时，B1和B2组中条带1和条带3消失，条带2(methanosaeta sp，产甲烷鬃毛菌)亮度减弱。而此时B1和B2组的H＇和产甲烷量均显著低于经体内代谢组，这可能是由直接加入组产甲烷杆菌和未培养的产甲烷古菌消失，以及产甲烷鬃毛菌数量减少造成的。

时间Time/d04828CK1.42±0.281.65ab±0.061.66±0.191.74b±0.09A11.46±0.361.51a±0.081.72±0.161.72b±0.05B11.47±0.341.72b±0.011.64±0.331.43a±0.21A21.43±0.321.58a±0.051.68±0.151.72b±0.14B21.48±0.171.75b±0.011.71±0.201.40a±0.16

表5 DGGE条带测序BLAST比对结果Table 5 BLAST results of DGGE band sequences

由图3可知，试验开始时，各试验组产甲烷菌群落结构一致，相似性水平为1。试验第4天时，B2中产甲烷菌与其它试验组相似性降低。第8天时，加入SMZ的试验组产甲烷菌群落结构与CK组相比相似性进一步降低。在试验结束时，A1和A2组中产甲烷菌群落结构与CK组相似性为1，与B1和B2组相似性为0.86，说明采用两种研究方法的试验组间产甲烷菌群落出现差异。

3 讨 论

3.1 SMZ及N4-ACE-SM2浓度在厌氧消化系统中的变化规律

SMZ在猪场废水中降解方式以微生物降解为主，并且在厌氧条件下的降解速率高于好氧试验组[14]。本研究在避光厌氧条件下进行，因此微生物降解可能是系统中SMZ浓度降低的主要原因。本研究在试验浓度条件下，两种研究方法并没有显著影响厌氧消化系统中SMZ的累积和降解速度；相同研究方法但加入不同浓度SMZ的试验组间差异也不显著，其原因可能是猪粪收集试验所收集的猪粪中SMZ的最高浓度和最低浓度差异较小，分别为56.04 mg/kg和47.10 mg/kg，因此不同加入浓度间未表现出显著差异。

虽然经体内代谢后含SMZ的猪粪中同时含有N4-ACE-SM2，而且其含量为其原形浓度的50%左右，但在厌氧消化系统中其浓度却与直接加入组无显著差异，说明与直接加入法相比，采用经体内代谢法时厌氧消化系统中N4-ACE-SM2的降解速度会更快。由于经体内代谢法中含有更多的N4-ACE-SM2，因此可能造成微生物对于N4-ACE-SM2的降解速度高于直接加入组[15]。研究表明，N4-ACE-SM2在废水中的降解速度高于在无菌的超纯水中，说明微生物对N4-ACE-SM2的降解起着重要作用[16]。采用经体内代谢法所用猪粪中同时含有SMZ和N4-ACE-SM2，但结果表明，两种方法下SMZ和N4-ACE-SM2的浓度变化趋势相似，且浓度无显著差异。这可能是由于进入到系统中的N4-ACE-SM2并没有影响其母体的降解速度，同时经体内代谢组可能有更多的N4-ACE-SM2，其降解速度也快于直接加入组。此外，高浓度SMZ经体内代谢的猪粪含有更多的代谢产物，可以增强兽药对系统中微生物的抑制作用[15]，从而影响有机质的分解速度和甲烷的产生。

3.2 SMZ对厌氧消化系统产甲烷量的影响

若抗生素初始浓度过高，会对厌氧消化系统中的微生物产生毒性，抑制微生物活性，造成甲烷产量下降[8,17]。有研究表明，当厌氧消化系统中磺胺甲恶唑的浓度在5～1 000 mg/L范围内，随着磺胺甲恶唑浓度升高，对累积产甲烷量的抑制率也越高[18]。Loftin等[19]研究也表明，在厌氧消化系统中直接加入不同浓度的SMZ，结果显示SMZ会抑制系统的产甲烷量。本研究表明，在停药期直接加入法与对照组和经体内代谢法相比，抑制了产甲烷量，这与Loftin等[19]研究结果相似。但在加药期，直接加入组产甲烷量显著高于经体内代谢组，这可能是由于直接加入组在初始时仅加入了SMZ，而经体内代谢组同时含有同浓度的SMZ和一定浓度的代谢产物，二者共同影响厌氧消化系统中微生物的活性，可能造成了该时期经体内代谢组产甲烷量受到抑制。而停药期直接加入组产甲烷量低于经体内代谢组，其原因可能是进入停药期后，经体内代谢组厌氧系统中微生物已经逐渐适应系统环境，但直接加入组系统中微生物活性仍受到SMZ原形及其代谢产物的抑制[20]，从而使系统产甲烷量下降。

于宸等[7]采用直接加入法探究SMZ对猪粪厌氧消化系统产气量的影响，结果表明，在系统中添加30，60，120 mg/kg的SMZ，系统中SMZ浓度越高则促进越多产酸菌群的生长，从而合成更多的甲烷形成的前体物质，以提高产甲烷量。该结果与本研究中采用直接加入法的B1组和B2组结果相似，本研究中B1组和B2组的产甲烷量在加药期高于停药期，而系统中SMZ浓度在加药期也高于停药期，说明SMZ浓度越高则系统产甲烷量越高。但在经体内代谢组则得到不同的结果，说明饲料中的SMZ经体内代谢后对猪粪厌氧消化系统产甲烷量的影响与直接加入法不同，经体内代谢法能更准确评估猪粪中残留SMZ对厌氧消化系统的影响。

3.3 SMZ对产甲烷菌多样性的影响

本研究中，在厌氧消化系统中加入SMZ时，不同的研究方法对系统产甲烷菌H＇变化有显著影响。加药期采用直接加入法的产甲烷菌多样性显著高于经体内代谢法；而停药期经体内代谢法的产甲烷菌多样性显著高于直接加入法。用直接加入法的产甲烷菌多样性呈先增加后减少的趋势，而用经体内代谢法的呈持续增加的趋势，且与对照组趋势相似。

有研究表明，采用直接加入法进行研究时，SMZ对猪粪厌氧消化过程中微生物群落功能多样性的影响较大。钱金秋[6]发现，直接加入SMZ抑制了厌氧消化系统的产甲烷量，在试验初期，添加SMZ的试验组与对照组相比明显降低了微生物群落的功能多样性和物种丰富度，这可能是由于抗生素的外来加入抑制了参与发酵的微生物活性。这与本研究结果中相似，本研究中，停药期直接加入组的产甲烷菌多样性和产甲烷量均受到抑制。

此外，本研究采用经体内代谢法与空白组的产甲烷菌群落结构相似度较高，而与直接加入法的相似性降低，因此经体内代谢法相比直接加入法能更准确反应SMZ残留对猪粪厌氧消化系统的影响，结果更贴近生产实践。

4 结 论

在猪粪厌氧消化系统中，两种研究方法对SMZ的累积和降解速度的影响无显著差异，但采用经体内代谢法时N4-ACE-SM2的降解速度更快；加药期时采用经体内代谢法显著抑制了产甲烷量，而停药期时采用直接加入法显著抑制了产甲烷量；采用经体内代谢法的产甲烷菌多样性和群落结构与空白组具有更高的相似性。因此，采用经体内代谢法评估SMZ对猪粪厌氧消化系统的影响更具合理性，可获得更准确的研究结果。