小麦单倍体育种方法研究进展

王 敏，闫贵云，左静静

（山西农业大学农学院，山西太原030031）

小麦常用的育种方法主要有杂交育种、诱变育种、单倍体育种、分子设计育种等[1-2]。其中，单倍体育种具有育种年限低、后代选择效率高等[3]优点，是近年来科研工作者比较青睐的方法。普通小麦为异源六倍体，其染色体有42条，单倍体小麦为三倍体，有21条染色体[3]。因此，单倍体植株的基因型和表现型是完全一致的，为研究遗传性状和育种提供优质材料。目前产生小麦单倍体的途径主要有离体培养、孤雌生殖等。笔者从这两大类途径出发，对其具体的方法进行对比分析和阐述，以期为后续的单倍体育种研究工作提供基础。

1 离体培养

小麦离体培养是指通过无菌操作分离小麦的一部分，接种于人工配制的培养基上，在人工控制的条件下进行离体培养最终获得再生植株的技术，主要包括花药离体培养和花粉离体培养。

1.1 花药离体培养

花药离体培养是小麦单倍体育种中比较成熟的方法之一，该方法自20世纪70年代开始在我国推广使用，但目前仍然存在基因依赖型、绿苗分化率低等难以克服的缺点。小麦的遗传物质对花药培养的影响最为显著。LANTOS等[4]以4种小麦材料及10种F1的品种进行双列杂交研究，结果表明，绿苗分化率最高的为85%，最低为6.3%。李雪等[5]通过9种小黑麦品系进行花药培养研究，结果表明，TZ26、TZ25和P4的出愈率及绿苗分化率较高，石大1号的出愈率较高，但绿苗分化率低。宋运贤等[6]通过采用完全双列杂交方法对部分皖北栽培小麦花药诱导率进行一般配合力效应、特殊配合力效应分析，并估算其遗传参数，结果表明，新麦208、烟农19、煤生0308具有较高的诱导率。大量研究表明，小麦花药离体培养的出愈率和绿苗再生主要受核基因控制[7-8]，同时也可能受细胞质因素[9-10]的影响；愈伤组织和绿苗再生是彼此独立的、受多基因控制的数量性状[11-13]。赵林姝等[14]以突变新种质H307与优质早熟品种郑麦9023为亲本，构建了含有131个株系的重组自交系群体，检测到4个与愈伤组织诱导率、绿苗产率、白苗分化率相关的QTL，分别位于5B、6B和3D染色体上；TORP[15]应用RFLP技术发现3个与绿苗率相关的QTL位点，分别在2AL、2BL、5BL上。这些结果为解决小麦花药的基因型限制问题奠定了一定的理论基础。

培养基和培养条件对花药培养也有不可替代的作用。杨雪等[16]以小麦花药为材料，对MS、N6、C17和K4这4种培养基在小麦花药离体培养中愈伤组织的诱导作用进行了比较。结果表明，小麦花药在4种培养基中愈伤组织诱导率从大到小排序为K4＞C17＞N6＞MS。杨雪等[17]以C17为基本培养基，研究了低温预处理和聚乙二醇对小麦花药出愈率的影响，结果表明，低温预处理4 d的小麦花药出愈率最高（2.108%），且稳定性较好（变异系数0.067），在培养基中加入100 mg/L PEG可显著提高小麦花药出愈率。赵永英等[18]通过在培养基中添加不同浓度的噻重氮苯基脲（Thidiazuron，TDZ）探讨其对小麦花药培养的作用，结果表明，TDZ的作用与添加剂量及小麦基因型密切相关，在分化培养基中添加0.5 mg/L的TDZ能够显著提高绿苗分化率（最高可达50.0%）和绿苗与白苗比率（最高为1.9）。吕学莲等[19]以103份不同基因型小麦为材料进行花药培养，结果表明，在愈伤组织诱导方面，C17培养基明显优于W14，而在绿苗分化方面，W14培养基诱导产生的愈伤组织绿苗分化的效果更好，同时高温培养比不进行高温培养的愈伤诱导率高。因此，要选择合适的培养基和培养条件进行花药离体培养，以期提高小麦的出愈率，降低白化苗的产生。

1.2 花粉离体培养

花粉培养是指当花粉发育到一定阶段，从花药中取出花粉所进行的单细胞无菌培养。小麦花粉培养又称小孢子培养，主要通过胚胎途径直接发育成植株，避免了愈伤组织阶段，减少因孢子体变异而引起的农艺性状退化，显著提高单倍体产生频率和减少白化苗的产生量[20]。

1993年，TUVESSON等[21]首先培养出了小麦的小孢子植株。随后，小麦的花粉培养技术得到了较广泛的研究和应用。胡含等[22]研究表明，90%的小麦花粉植株为染色体构型较稳定的单倍体和二倍体，其余10%的花粉植株为非整倍体、多倍体和混倍体，丰富和发展了小麦花粉离体培养的遗传学理论。李波等[23]以4个小麦品种为材料，对培养基中的蔗糖浓度、外源激素等对离体花粉中小孢子细胞分裂启动的诱导效果进行了研究。结果发现，小麦花粉培养的最适蔗糖浓度为3%，蔗糖浓度高于9%时不能启动花粉粒的脱分化及雄核发育，这说明外源激素的存在是花粉脱分化并进入雄核发育的必要条件，2，4-D在诱导花粉粒转向孢子体发育的过程中起主要作用。章静娟等[24]进一步研究不同杂交组合、不同培养基的因素对F1花粉植株再生的影响，结果表明，F1花粉植株再生频率在不同组合之间存在显著性差异；植物生长调节剂4PU-30和C17、K3、W14等3种培养基对花药的花粉出愈率、绿苗分化率和绿苗产量也产生影响。侯立江等[25]研究表明，小麦成熟花粉在20%蔗糖＋10% PEG4000＋40 mg/L H3BO3＋3×10-3mol/L Ca（NO3）2＋10 mg/L VB1中28℃培养30 min，通过镜检观察，可诱导萌发频率高达90%以上。杨随庄[26]则研究发现，植物血凝素（PHA）对小麦花粉的诱导频率也有影响。朱宏等[27]研究发现，对幼穗花药的低温前处理有利于花粉细胞分裂的启动，经6～9 d 7℃前处理于25～27℃下24～36 h培养，有利于花粉细胞分裂的启动。花粉离体培养的再生能力不仅仅与亲本密切相关，在进行小麦花粉培养时，要选择农艺性状优良的亲本，同时，选用合适的培养基和外源激素在适当的培养条件下进行培养，将有利于提高小麦花粉植株的再生频率。

2 孤雌生殖

孤雌生殖是指雌配子体不经过受精，在自身基因控制或其他因素刺激下直接发育成胚的一种无融合的生殖方式[28]。由于自发产生率低，常采用人工诱导的方法进行孤雌生殖，常用的方法有辐射花粉、化学诱导、异种属花粉延迟授粉、异种属细胞质-核替换法、远缘杂交等。

2.1 辐射花粉

辐射花粉授粉是指将父本花粉通过紫外线或γ、X、60Co、32P等射线照射后，然后授粉给去雄的母本，从而影响其受精过程诱发的孤雌生殖。辐射花粉诱导雌核发育单倍体的原理一般认为有2种：一种认为，花粉被射线照射时，生殖核丧失活力，只能刺激卵细胞分裂发育，不能起到受精的作用；另一种观点认为，生殖核染色体数目异常不能与卵细胞配对导致无法受精[29]。一般认为，该方法与小麦的基因型、辐射源和剂量等因素有关。李德炎[30]用被X射线照射过的1粒小麦花粉给未授粉的小麦柱头授粉，诱导率为17.6%。胡启德等[31]用60Co-γ线处理普通小麦的花粉，给去雄的杂种F1植株授粉，诱导孤雌生殖，结果表明，剂量6 000 Gy的诱导成功率最高为7.5%。王献平[32]在诱导小麦-中间偃麦草易位系的工作中得到了比较理想的结果（易位频率为2.9%），其通过进一步研究报道了利用低剂量γ射线辐射花粉的方法诱导小麦-滨麦易位系，这为小麦利用其他种属的优良基因改善其自身的品种奠定了基础。

2.2 化学诱导

化学诱导是指将小麦母本去雄，然后用化学试剂诱导小麦进行孤雌生殖。这种方法操作简单，目前发现，DMSO、PCPA、KT、2，4-D、NAA、GA3、TRTA、DMSO＋对氯苯氧乙酸、DMSO＋KT、DMSO＋GA3、DMSO＋NAA、DMSO＋邻氯苯氧乙酸、DMSO＋KT＋邻氯苯氧乙酸等都可以成功地诱导小麦进行孤雌生殖[33]。不同的化学试剂和浓度对小麦的诱导效果不同。孙耀中等[34]研究发现，动物雌激素的诱导效果按照诱导结实率的大小排序为甲地孕酮（1.34%）＞炔诺酮（1.01%）＞乙烯雌酚（0.98%）；对氯苯氧乙酸以500 mg/L的诱导结实率最高，为4.6%，肌醇以100 mg/L的诱导结实率最高，为4.2%，2，4-D以10 mg/L的诱导结实率最高，为3.4%。陈传永等[35]以16个品系为材料，在3月底用1 500 mL/hm2津奥啉对小麦进行去雄处理，然后套袋隔离直至收获。5月份用不同的诱导剂进行孤雌生殖诱导，结果表明，适当浓度的NAA、GA3、Col、MH都有利于诱导小麦，且含有Ca（NO3）2的配方中，结实率比较高。其具体的诱导机制不详，仍需进一步探究。

2.3 异种属花粉延迟授粉

卵细胞接受亲缘关系较远的花粉很难受精，但却能受到刺激从而孤雌生殖产生单倍体。异种属花粉诱导小麦孤雌生殖的诱导率一般比较低，因此，往往结合延迟授粉的方法提高诱导率。常用的异种属一般为黑麦，但诱导结实率一般不超过5%[36-37]。陶少武等[38]研究发现，用由硬粒小麦和黑麦杂交并加倍后的六倍体小黑麦作为授粉者，结实率最高可达到17.7%，可能是由于六倍体小黑麦容易在普通小麦柱头上萌发并顺利到达胚囊，只能刺激卵细胞分裂，自身精核不易与卵细胞融合而最终崩解。多数研究表明，一般延迟7～9 d授粉的效果较好[30，35-36]。苗芳等[39]采用延迟7～9 d的授粉和石蜡切片的方法，研究了黑麦花粉、小黑麦花粉以及黑麦和小黑麦花粉分段授粉诱导小麦孤雌生殖，结果表明，用黑麦和小黑麦花粉分段授粉时，不仅易形成胚乳，而且易形成同时具有胚和胚乳的胚囊，其诱导频率最高为23.1%。

2.4 异种属细胞质-核替换法

KIHARA[40]研究发现，某些山羊草的细胞质和普通小麦的细胞核组成的核质杂种，具有雄性不育的特点，能够产生较高频率的单倍体。目前已经发现的细胞质供体[41]主要有：尾状山羊草、粘果山羊草、易变山羊草、高大山羊草、欧山羊草、离果山羊草、小亚山羊草和小伞山羊草、二角山羊草和偏凸山羊草。这些山羊草在作为细胞质的供体时各有优缺点，诱导率也各不相同。多数试验[42-44]表明，外源细胞质诱导小麦单倍体的机制主要受细胞核和细胞质的双重控制，小麦1B/1RS易位系的1R短臂上有一个控制孤雌生殖的显性基因Ptg，该基因与细胞质互作时产生单倍体。刘庆法等[45]研究表明，只要雌配子体带有Ptg基因即有发育成单倍体的潜力；父母本基因型与单倍体频率有密切关系，但父本是否具有Ptg基因与诱导频率无关。Ptg基因在普通小麦细胞质背景下也可以表达，但外显率较低[46]。

2.5 远缘杂交（染色体消除法）

远缘杂交技术可以利用异种的特殊优良性状，把有益的基因转移到小麦中，从而克服常规育种的缺点，扩大小麦的种质资源。目前，应用远缘杂交技术获得小麦单倍体中最广泛使用的是玉米花粉和球茎大麦。

普通小麦和玉米之间杂交，能够发生高频率的受精作用和胚胎形成。小麦×玉米产生的杂合子核型高度不稳定，在受精后杂种合子的最初几次分裂中，父方染色体很快排除，形成小麦单倍体的幼胚[47]。丁明亮等[48]用糯、甜糯、甜、超甜4种类型共8个玉米品种分别与6个小麦DH系杂交诱导产生小麦单倍体胚，结果表明，4种玉米类型间平均单倍体胚得胚率以甜糯型最高（33.86%）、超甜型最低（29.59%），相同玉米类型而基因型不同的玉米品种间单倍体胚得胚率差异大于玉米类型间单倍体胚得胚率的差异。刘琨等[49]探讨简化去雄方法对成胚率的影响，结果表明，剪颖不去雄的去雄效率比常规去雄高5倍以上，单倍体胚成胚率相同，可作为小麦×玉米杂交中批量产生小麦单倍体的高效去雄方法。研究表明，Kr1基因是小麦远缘杂交不亲和主效基因。蔡华等[50]比较了小麦自花授粉和小麦×玉米远缘杂交2个过程中Kr1基因的表达差异，结果表明，DNA甲基化修饰参与了Kr1基因在小麦×玉米远缘杂交中的表达调控。

KASHA等[51]研究认为，球茎大麦与母本株授粉后，在形成胚胎的早期，球茎大麦的染色体在合子中逐渐消失（或被排除），仅剩余母本的染色体，幼胚经离体培养得到单倍体植株。胡道芬等[52]利用德国球茎大麦作为父本、4种普通小麦为母本得出小麦基因型不同，则结实率和出苗率不同。李大玮等[53]研究得出，小麦经用球茎大麦花粉授粉14 d后的未成熟胚，经2℃的冷贮处理后能够提高再生成植株的频率。胡超等[54]用石蜡切片法，对普通小麦异源2号、中国春与球茎大麦远缘杂交受精过程和早期胚胎发育进行比较观察，结果表明，异源2号和中国春与球茎大麦远缘杂交，其受精和胚胎发育存在着明显差异，造成这一差异的原因可能是由于异源2号仅具1对Kr基因，而中国春具有Kr1、Kr2、Kr3等3对杂交亲和性基因。

3 讨论

小麦单倍体的育种已经有了较广泛的研究，每种方法各有优缺点，但大都存在诱导率低、绿苗分化率低等缺点，需要科研工作者深入结合小麦的基因和遗传调控等进行具体的分析和研究。同时，可以通过小麦不同基因型的研究，将上述多种诱导方法相结合，进行抗病、抗盐碱、抗倒伏等品种的选育。相信随着染色体工程的逐步建立和应用，小麦单倍体育种的工作将会得到更为广阔的发展。