树莓种子休眠原因探究

杨国慧，范珍珠，李 玲，李铁梅，郭潇雨，张蕴瑭，王一凡

（1.东北农业大学园艺园林学院，哈尔滨 150030；2.农业农村部东北地区园艺作物生物学与种质创制重点实验室，哈尔滨 150030）

树莓（Rubus idaeusL.），又称托盘、悬钩子等，属于蔷薇科（Rosaceae）悬钩子属（RubusL.）多年生半灌木性小浆果果树[1]。树莓可采用实生、根蘖和组织培养等繁殖方法，生产中主要采用根蘖苗和组培苗，育种中常用种子实生繁殖[2]。树莓种子小、发芽率低，种子萌发时间达半年以上，出苗不整齐，影响获得杂种实生苗[3]。

种子休眠原因一般分为五种：①形态休眠（Morphological dormancy，MD），是指种子中胚某个部位发育不完整或不全，如胚芽、胚轴、子叶等；② 生理休眠（Physiological Dormancy，PD），主要由胚内部生理因素造成；③形态生理休眠（Morphophysiological dormancy，MPD），则是上述两种因素共同形成；④物理休眠（Physical dormancy，PY），主要是由于种子种皮和外壳栅栏组织细胞阻止种子吸收水和氧气，使种子难以萌发；⑤混合型休眠（PY+PD）[4-6]。目前认为，果树种子属于混合型休眠居多，种子外部有一层硬实且隔水的种皮或外壳，同时种胚中抑制物导致生理休眠[7-8]。有关树莓种子休眠原因研究较少，一般认为种皮厚而致密是种子难以萌发主要原因，种皮和胚乳中的抑制物质也可能影响种子萌发。Shahzad等研究表明，即使树莓种子受相同破皮、层积和外源激素处理，其最终发芽率仍相差较大，认为树莓种子萌发存在基因型差异[9]。

为全面了解影响树莓种子萌发因素，本研究通过从种子解剖观察、种皮透气透水性试验、种子不同部位（内果皮、种皮、胚和胚乳）中抑制物以及内源激素影响等方面综合分析树莓种子休眠原因，旨在为提高树莓种子萌发率方法提供理论依据，加快树莓杂交育种工作进程。

1 材料与方法

1.1 材料

以夏果型树莓“大红树莓”为试验材料，于东北农业大学实验实习与示范向阳基地农场采集3种不同果实成熟期（青果期、白果期和成熟期）种子。果实成熟期划分参考文献[10]方法，其划分标准为：青果期果实体积小、硬度较大，颜色呈青绿色，与花托紧密结合；白果期果实稍大且颜色呈黄白色；成熟期果实全部着色呈深红色，与花托分离。

1.2 方法

1.2.1 种子显微结构观察

试验采用3种不同果实成熟期采集的种子，FAA固定液（70%乙醇：福尔马林：冰醋酸=90∶5∶5）固定，采用常规石蜡切片法制片，番红、固绿染色，光学显微镜（MoticBA210）下拍照观察。

1.2.2 破皮对种皮透气透水性及种子萌发的影响

破皮对种皮透气透水性影响：取成熟期种子5 g，于种子背部破皮处理，用于透气透水性试验。种皮透水性测定具体方法参考常青山等[11]，种皮透气性测定：将破皮种子置于广口瓶中，25℃温水中浸泡3 d，CO2呼吸分析仪（GXH-3010E1）测定瓶内初次CO2释放量，然后将瓶子于恒温箱中（25℃）静置2 h，再次测定CO2释放量。公式如下：

式中，C1-初始CO2含量（μmol·mol-1）；C2-t时间后CO2含量；V0-测定温度下CO2物质的量体积（L·mol-1）；N-种子鲜重（kg）；T-放置时间（h）。

破皮对种子萌发影响：在4℃冰箱冷藏0、30 d后取出，分别在种子胚根端、胚乳端、种子背部横切，置于25℃恒温箱，观察种子萌发情况，以未处理种子为对照。

1.2.3 树莓种子提取物对白菜种子发芽的影响

采用果实成熟期未经冷藏处理和冷藏180 d（4℃）树莓种子，利用甲醇提取法分别提取内果皮、种皮、胚与胚乳抑制物[12]。首先在培养皿中铺好滤纸，分别加入树莓种子各部位甲醇提取物1 mL，然后再播种30粒白菜种子，以蒸馏水为对照（CK），48 h后统计白菜种子发芽率，测量胚根长度。将种子各部位甲醇提取物按图1中所示流程分离，获得7个分离相，用其提取液作白菜种子发芽试验，方法同文献[12]。

1.2.4 种子内源激素含量测定

选用3种不同果实成熟度采集以及不同冷藏（4℃）天数（30、60和90 d）种子，其中果实成熟期采集和冷藏90 d（4℃）种子分别取3个部位：内果皮、种皮、胚与胚乳。

采用液相色谱法测定IAA、ABA、6-BA、GA3内源激素含量，提取方法参照张占畅等[13]。液相色谱条件：C18色谱柱（5 μm，4 nm×250 nm），柱温为室温，流动相是乙腈：甲醇：70%冰乙酸（体积比5∶50∶45），流速为0.8 mL·min-1，进样量为20 μL，检测波长为260 nm，采用仪器为高效液相色谱仪，仪器型号为APS-80-16A。

1.2.5 数据分析

上述试验均3次重复，利用Excel 2007和SPSS 17.0对数据作方差分析和多重比较（Duncan法），小写字母表示P≤0.05差异显著。

2 结果与分析

2.1 种子显微结构观察

树莓种子解剖结构观察表明，树莓种子由内果皮、种皮、胚乳与胚组成。内果皮较厚且表面坚硬，随种子不断发育，内果皮慢慢变薄，到成熟期种子内果皮平均厚度减至133.40 μm；而种皮逐渐增厚，到成熟期种皮厚度增至25.05 μm；胚乳层与种皮紧密结合，随种子发育逐渐变薄；白果期时两片子叶分离，到成熟期完全分离（见表1和图2）。

2.2 破皮对种皮透气透水性及种子萌发的影响

破皮和完整种子0～6 h阶段吸水量增加趋势均比较明显，但破皮与完整种子吸水量相比明显增多。6～12 h时，破皮种子吸水量不变，完整种子吸水量仍缓慢增加。破皮种子浸泡6 h即达到饱和状态，而完整种子则在12 h达到饱和状态，可见树莓种皮对种子吸水率存在抑制作用（见图3）。

根据公式计算得出，放于密闭空间内2 h后，完整种子呼吸速率为23.135 mg·kg-1·h-1，刺破种皮处理后种子呼吸速率为57.762 mg·kg-1·h-1。由此可见，破皮种子呼吸速率明显高于完整种子呼吸速率（见图4）。成熟期采集未冷藏种子，在胚乳端、胚根端、种子背部横切，两周后出苗率分别为13.04%、0.10%、0，对照为未出苗，而冷藏30 d破皮处理种子和对照均未出苗（见图5）。

2.3 树莓种子提取物对白菜种子发芽的影响

果实成熟期采集未冷藏树莓种子与冷藏180 d种子其各部位甲醇提取物对白菜种子发芽率及胚根生长均有显著抑制作用，其中胚与胚乳甲醇提取物抑制作用最为显著，两个时期白菜种子发芽率分别为12.23%和0，胚根长度分别为4.32 mm和0 mm。各部位甲醇提取物抑制作用由强到弱依次为胚与胚乳、种皮、内果皮。两个不同时期树莓种子中，胚与胚乳部分甲醇提取物均显著抑制白菜种子发芽率及胚根生长。与未冷藏种子相比，冷藏180 d种子中内果皮和种皮部分甲醇提取物对白菜种子发芽率和胚根长抑制作用变弱，而胚与胚乳部分抑制作用增强，发芽率为0（见表2）。

表1 不同发育时期树莓种子显微结构观察Table 1 Observation on the microstructure of raspberry seeds at different developmental stages (μm)

表2 不同冷藏时期树莓种子提取物对白菜种子发芽及其胚根长度的影响Table 2 Effects of extracts of raspberry seed in different cold storage periods on the germination and radicle length of cabbage seeds

未冷藏树莓种子内果皮甲醇提取物7个分离相中，B、D相显著抑制白菜种子发芽率和胚根生长，萌芽率和胚根生长均为0，其他相抑制程度强弱依次为F、C、G、E、A相。而冷藏180 d后，A、B、F相抑制作用最明显。其余依次为G、C、E、D相。通过比较可看出，冷藏180 d后A、F相抑制作用明显上升，C、D、E、G相抑制作用下降，B相抑制作用不变（见表3、4）。

表3 不同冷藏时期树莓种子各部位分离相对白菜种子发芽率的影响Table 3 Effect of separated phase of raspberry seed parts in different cold storage periods on the germination rate of cabbage seed

表4 不同冷藏时期树莓种子各部位分离相对白菜种子胚根生长的影响Table 4 Effect of the separated phases of raspberry seed parts in different cold storage periods on growth of radicles of cabbage seeds

未冷藏树莓种子种皮部位甲醇提取物7个分离相中，A、B、F相显著抑制白菜种子发芽率和胚根生长，萌芽率和胚根生长均为0。其他相抑制程度强弱依次为C、G、E、D相。而冷藏180 d后，A、B、F相抑制程度最强，其余依次为G、C、E、D相。通过比较可看出，冷藏180 d后，A、B、F相抑制程度无变化，而C、D、E、G相抑制程度降低（见表3、4）。

未冷藏树莓种子胚与胚乳部位甲醇提取物7个分离相中，G、B显著抑制白菜种子发芽率和胚根生长，发芽率分别为3.33%和9.0%，胚根长分别为3.38和7.90 mm。其他相抑制程度强弱依次为C、E、F、D、A相。而冷藏180 d后，A、B、F相抑制作用最强，其余依次为D、C、E、G相。通过比较可看出，冷藏180 d后，A、B、F相抑制作用明显增强，C、E、G相抑制作用下降，D相抑制作用无变化（见表3、4）。

2.4 种子内源激素含量测定

树莓种子中IAA含量在青果期种子中最少，为36.25 μg·g-1，从青果期到冷藏 60 d，呈递增趋势，冷藏90 d种子中IAA含量下降，为52.33 μg·g-1（见图6A）。ABA含量从青果期到白果期降至18.71 μg·g-1，果实成熟期时显著上升到最大值85.33μg·g-1后，逐渐下降（见图6B）。青果期到白果期GA3含量逐渐降至最低，为20.79 μg·g-1，此后呈显著递增趋势，于冷藏90 d达最大值，为30.16 μg·g-1（见图6C）。种子中6-BA含量变化在生长时期呈显著增加趋势，青果期含量最低为6.23 μg·g-1，冷藏 90 d后，6-BA 含量达最大值 22.16 μg·g-1（见图6D）。

如图7所示，IAA含量最多部位均为种皮部分，种皮中IAA含量随冷藏天数增加而增加。果实成熟期时IAA含量最少的部分是胚与胚乳，含量为10.2 μg·g-1，冷藏90 d后，IAA含量最少部位为内果皮，含量11.93 μg·g-1（见图7A）。果实成熟期种子中ABA含量最高部位为内果皮，含量为40.21μg·g-1，其次是胚与胚乳，种皮最低。冷藏90 d种子中ABA含量最高为胚与胚乳部分，15.76 μg·g-1（见图7B）。成熟期时GA3含量为种皮最高、内果皮最低，分别为11.56和3.79 μg·g-1。冷藏90 d种子中含量最多部位为胚与胚乳11.23 μg·g-1，含量最少部位为种皮7.31 μg·g-1（见图7C）。果实成熟期和冷藏90 d树莓种子中6-BA含量变化趋势相同，随冷藏天数增加，各部位6-BA含量逐渐增多，成熟期胚与胚乳部位6-BA含量为8.13 μg·g-1，冷藏90 d后含量增至9.23 μg·g-1（见图7D）。通过对比可看出，果实成熟期未冷藏种子内果皮、种皮、胚与胚乳中含量最高为ABA，冷藏90 d后含量最高为IAA。

3 讨论

树莓果实属于聚合小核果，其种皮主要由子房内壁发育成的内果皮和珠被发育成的种皮两部分组成[14]。本研究解剖构造观察发现，从青果期到果实成熟期树莓种子内果皮虽逐渐变薄，但果实成熟期种子其内果皮占种子比例较大，其厚度约为种皮5倍，且呈“齿轮状”。利用一定浓度硫酸处理树莓种子，可提高种子萌发率，加快萌发速度[15]。本研究树莓种子破皮处理后透水透气性增强，化学和物理方法可破坏种皮坚硬结构，促进种子萌发。由此可知，内果皮和种皮结构致密，尤其是内果皮较厚，阻碍种胚吸收水分和氧气，此为影响树莓种子萌发的主要因素。

丁言等研究表明，牡丹种子浸提液显著抑制白菜种子萌发[16]。由树莓种子各部分（内果皮、种皮、胚和胚乳）抑制物对白菜种子发芽率的影响可知，无论是未经冷藏种子还是冷藏180 d树莓种子，胚与胚乳部分甲醇提取物抑制作用最强。在破皮试验中也发现，破坏树莓种子胚乳端后两周内种子发芽率达13.04%，且观察到在胚乳端有脂类物质析出，推测此类物质可能为不饱和脂肪酸。也有研究证明，树莓种子中含有较多亚油酸、亚麻酸、油酸等不饱和脂肪酸物质，而亚麻酸和亚油酸含量高可能导致种子活力下降[17]。对未冷藏和冷藏180 d树莓种子甲醇提取物初步分离得到7个分离相分析结果表明，未冷藏树莓种子中胚与胚乳部分抑制物主要为B、C、G相。根据杨晓玲等研究结果，C相抑制物质为酸性物质，可能为脱落酸（ABA）类[12]。冷藏180 d的C相提取液对白菜种子抑制作用已降低，说明随冷藏天数增加ABA含量逐渐降低，与树莓种子中激素含量测定结果一致。上述研究表明，胚和胚乳层抑制物也是抑制树莓种子萌发重要因素。

植物内源激素在种子萌发与休眠过程中发挥重要作用[18]。一般认为，6-BA、GA3对打破种子休眠具有积极调控作用，而ABA促进种子休眠，关于IAA作用目前尚无定论[19]。本研究中随果实发育和种子冷藏时间增加，IAA、6-BA、GA3呈增加趋势，ABA含量果实成熟期达峰值，之后持续下降。激素对于种子萌发影响不仅与内源激素绝对含量有关，各激素之间相互平衡也与种子萌发关系密切，特别是与促进种子萌发激素和抑制种子发激素比例有关。本研究中6-BA、IAA、GA3与ABA比值变化规律相似，青果期到白果期上升，成熟期降至最低，而后逐渐升高，冷藏90 d后IAA/ABA、6-BA/ABA、GA3/ABA值均达到最大，说明激素对种子休眠起综合调控作用。果实成熟期采集的种子中ABA含量较高，但随种子冷藏天数增加，激素含量转而利于萌发，激素不再是影响种子萌发主要因素。

综上所述，树莓种子应属于混合型休眠。其中既有厚而致密的内果皮造成物理性休眠，也有因种子内部，特别是胚和胚乳中抑制物造成生理性休眠。但从树莓种子不同部位提取物分离相对白菜种子抑制试验可看出，树莓种子中抑制物存在部位多、种类多，且随冷藏时间变化而变化。因此，提高树莓种子萌发率，除了破坏种皮结构，还应明确冷藏时间及种子部位（特别是胚和胚乳中抑制物成分）对种子萌发的影响。