响应曲面法优化超声辅助提取芒果叶中多酚和黄酮工艺及抗氧化活性研究

张 静，陶俊葓，刘 银，刘 倩，杨周昊，李孟容，程桂广

(昆明理工大学 农业与食品学院，云南 昆明 650500)

芒果(MangiferaindicaL.)是最具经济价值的热带植物之一，其独特的风味和丰富的营养物质广受人民喜爱，主要产于热带、亚热带地区[1]，我国是芒果主要生产国之一，资源非常丰富.芒果叶作为芒果的农副产品，产量丰富，含有大量天然抗氧化剂，如酚酸、类黄酮、木质素和半裂环烯醚类等[2].芒果叶具有平喘、止咳、去痰、免疫、抗炎、镇痛、抗肿瘤、抗病毒、抗菌、和抗氧化活性[3].多酚和黄酮类成分是其重要的生理活性物质[4-5].

目前植物功能成分的提取方法有溶剂浸提法，酶解法，超声辅助提取法，微波辅助提取法和超临界流体萃取法[6-7].其中，超声波辅助提取是利用超声波产生的热效应、机械作用使植物细胞内可溶性物质快速释放、扩散并溶解进入溶剂中，同时可以较好地保持提取物的结构和活性，具有时间短、提取率高[8]，消耗溶剂少、避免高温对有效成分的破坏等特点，对酚类等热敏性物质，超声提取优势尤为明显[9].

响应曲面法通过建立连续变量的模型，对各影响因素及交互作用进行优化和评价，同时用曲面图和等高线图表示出来，比正交设计更直观、精确，该方法已广泛用于中药提取、食品工业等领域[10].本文采用超声辅助提取方法对芒果叶中的多酚和黄酮进行提取，通过响应曲面法对提取溶剂、料液比以及提取时间3因素进行工艺优化，确定最佳提取工艺，并研究其抗氧化活性，为芒果叶进一步开发利用提供参考.

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

芒果样品于2019年7月采摘于云南元江，经真空冷冻干燥 48 h 过0.441 mm筛后保存于冰箱备用.

甲醇、乙醇、丙酮均购买上海可高纯溶剂有限公司；TPTZ、DPPH、ABTS、福林酚试剂、没食子酸标准品(分析纯)购于Sigma-Aldrich 公司；实验室准备蒸馏水.

1.2 主要仪器与设备

ZD-F12真空冷冻干燥机(南京载智自动化设备有限公司)；AL204型电子天平(梅特勒-托利多上海有限公司)；TDL-40B型离心机(上海安亭科学仪器厂) ；SpectraMax M5 多功能酶标仪(美国Molecular Devices公司)；SCQ-数控加热超声波清洗机(上海声彦超声波仪器有限公司)；UPHW-I-90T优普系列超纯水机(成都超纯科技有限公司)；电热鼓风干燥箱(上海一恒科学仪器有限公司)；Q250B型高速多功能粉碎机(上海冰都电器有限公司)；旋转蒸发器(上海爱郎仪器有限公司).

1.3 方法

1.3.1 多酚黄酮含量测定

参照文献[11]，用Folin-Ciocalteu (FC)法测定提取物的总酚(TPC)含量.样品用甲醇溶解，在 0.5 mL 的FC试剂和 0.4 mL 蒸馏水的混合液中加入提取物溶液 0.6 mL，混合均匀，反应 1 min 后，分别加入 1.5 mL Na2CO3(m/v=0.2 g/mL)和 6 mL 蒸馏水.将整个反应体系放置在 70 ℃ 下水浴 10 min.待冷却到室温，在 765 nm 下，通过酶标仪测其吸光值.没食子酸作为标准品，绘制标准曲线.总酚含量表示为每克样品中含有没食子酸(GAE)的量(mg GAE/g提取物).

1.3.2 黄酮含量的测定

总黄酮(TFC)的含量根据文献[12]所描述的比色法测定.在 0.3 mL 的5%NaNO2和 3.8 mL 70%乙醇混合液中添加 1.2 mL 的提取物溶液，使其充分混合，反应 8 min 后，分别加入 0.3 mL 10% Al(NO3)3、4.0 mL 4% NaOH、0.4 mL 的70%乙醇溶液、混合体系在室温下反应 12 min 后，用酶标仪在 510 nm 处测量吸光度.芦丁作为标准品，做标准曲线，样品的总黄酮含量表示为每mg样品含有芦丁(RE)的量(mg RE/g提取物).

1.3.3 单因素实验设计

分别考察溶剂类型(70%乙醇、70%甲醇、70%丙酮、蒸馏水)、乙醇体积分数(50%、60%、70%、80%、90%)、料液比(g/mL)(1∶15、1∶20、1∶30、1∶35)、超声时间(20、30、40、60 min)对芒果叶多酚、黄酮含量的影响.

1.3.4 响应曲面法优化实验设计

在单因素实验结果的基础上，固定提取溶剂为乙醇，通过Box-Behnken方法设计响应面，将芒果叶多酚、黄酮含量(mg/g)(Y)作为响应值，选取乙醇体积分数(A)、料液比(B)和提取时间(C)3个因素，进行响应面分析(3因素3水平)，实验设计见表1.

表1 响应曲面实验因素水平表

1.3.5 DPPH自由基清除能力的测定

使用比色法[13]测定芒果叶的DPPH自由基清除能力.0.1 mmol/L DPPH工作液需要现用现配的，0.5 mL 的提取物溶液或Trolox标准溶液与 2 mL DPPH工作液混合，混合均匀后，在 25 ℃ 下避光反应 30 min.用酶标仪在 517 nm 处测量吸光度.提取物的DPPH自由基清除能力按公式(1)计算.

(1)

其中，A0空白对照组吸光值：0.5 mL 乙醇 + 2.0 mL DPPH工作液；Ax0样品对照组吸光值：0.5 mL 样品 + 2.0 mL 乙醇；Ax样品吸光值：0.5 mL 样品 +2.0 mL DPPH工作液.

1.3.6 ABTS自由基清除能力的测定

ABTS自由基清除能力的测定方法按照现有文献[14]的报道并稍作修改.7 mmol/L ABTS+溶液和 40 mmol/L 的过硫酸钾溶液按照5∶88比例进行混合，使混合液在室温避光条件下反应 12 h 后，得到ABTS+工作液.1 mL ABTS+工作液用 100 mL 左右的无水乙醇进行稀释，在波长 734 nm 使其吸光值为0.7 ± 0.02. 0.5 mL 的提取物溶液或Trolox溶液中加入 4 mL 的ABTS+，使其充分混匀，混合液在 37 ℃ 的避光环境中反应 6 min，之后使用酶标仪在 734 nm 下测定吸光值.以Trolox作为标准品，做标准曲线.提取物的ABTS自由基清除能力按公式(2)计算.

(2)

其中，A0空白对照组吸光值：0.5 mL 乙醇 + 4.0 mL ABTS工作液;A1样品对照组吸光值：0.5 mL 样品 +4.0 mL 乙醇;A2样品吸光值：0.5 mL 样品 + 4.0 mL ABTS工作液.

1.4 数据处理与统计分析

每组实验均重复3 次，结果表示为均值±方差，采用Origin 8.5绘图软件绘图，SPSS 17.0对数据进行统计学分析，并进行差异分析，p<0.05表示差异显著.

2 结果与分析

2.1 单因素实验结果

2.1.1 溶剂类型对芒果叶多酚和黄酮含量的影响

如图1所示，用体积分数为70%乙醇、70%甲醇、70%丙酮和蒸馏水按1∶25(g/mL)的料液比和 30 min 超声时间在同一超声波清洗仪中超声3次所得到的芒果叶多酚、黄酮含量(mg/g).结果显示，多酚、黄酮的提取结果一致，含量由高到低依次是70%乙醇>70%甲醇>70%丙酮>蒸馏水.70%乙醇提取芒果叶多酚的能力与稍稍高于70%甲醇，但两者差别不大，因为到甲醇具有一定的毒性，故选择提取溶剂为70%乙醇.

2.1.2 乙醇体积分数对芒果叶多酚和黄酮含量的影响

如图2所示，用体积分数为50%、60%、70%、80%的乙醇按1∶25(g/mL)料液比和 30 min 超声时间在同一超声波清洗仪中超声3次所得到的芒果叶多酚、黄酮含量(mg/g)，结果显示当乙醇浓度为70%的芒果多酚、黄酮含量(mg/g)最高，当乙醇体积分数在50%～70%，多酚含量(mg/g)增加，而当乙醇体积分数超过70%时，多酚含量(mg/g)明显下降.因为溶剂体积分数较低时不能完全溶解植物体内的多酚物质，而溶剂体积分数过高又会溶出植物体内其他醇溶性或脂溶性杂质从而导致多酚含量(mg/g)降低.因此选择70%乙醇作为最适溶剂.

图1 溶剂类型对芒果叶多酚(A)和黄酮(B)含量的影响

图2 乙醇体积分数对芒果叶多酚(A)和黄酮(B)含量的影响

2.1.3 料液比对芒果叶多酚和黄酮含量的影响

如图3所示，用体积分数70%乙醇按料液比 1∶15、1∶20、1∶30、1∶35(g/mL)在同一超声波清洗仪中超声 30 min，提取3次所得到的芒果叶多酚、黄酮含量(mg/g)，结果显示当料液比为 1∶20 时，芒果叶多酚、黄酮含量(mg/g)最高，再增加料液比时，多酚、黄酮含量(mg/g)降低.原因可能是过多的溶剂溶解了植物体内其他杂质从而导致多酚、黄酮含量降低.因此从提取效果和经济条件综合考虑，最适料液比为 1∶20(g/mL).

2.1.4 提取时间对芒果叶多酚和黄酮含量的影响

如图4所示，同时用体积分数70%乙醇按料液比1∶20(g/mL)在同一超声波清洗仪超声20、30、40、60 min 所得到的芒果叶多酚、黄酮含量(mg/g)，结果显示当超声时间在 30 min 和 60 min 时多酚含量较高且两者相差不大，考虑到经济因素，选择最适超声时间为 30 min.

图3 料液比对芒果叶多酚(A)和黄酮(B)含量的影响

图4 提取时间对芒果叶多酚(A)和黄酮(B)含量的影响

2.2 响应曲面法对芒果叶多酚黄酮含量提取工艺优化的结果

通过单因素试验结果来看，乙醇体积分数、料液比、提取时间对芒果叶多酚、黄酮含量的影响相对较大，所以选择这3种因素再进一步设计Box-Behnken，响应曲面实验设计方案与结果见表2.

表2 响应曲面实验设计方案与结果

续表

用Design-Expert 8.0.6.1软件对数据进行处理，得芒果叶多酚含量Y1和黄酮含量Y2(mg/g)对乙醇体积分数(A)、料液比(B)和提取时间(C)的二项式多项回归方程为：

Y1=45.09-3.88A+2.85B+0.45C-0.29AB-0.85AC-2.82BC+3.58A2-0.36B2-4.38C2

Y2=5.74-0.27A+0.65B+0.22C-1.09AB+0.070AC+0.23BC+-0.042A2-1.07B2-0.84C2

由表3可知，模型的p值小于0.05该模型，表明该模型差异显著.模型的相关系数R2= 0.885 4，表明该模型拟合度良好，模型的调整确定系数R2adj=0.738 1，表明该模型能够解释73.81%的响应值的变化.用此模型来分析和预测超声提取芒果叶中的多酚效果是可行的.从方差分析结果来看，一次项A、B，二次项A2、C2对芒果叶多酚的提取影响是显著的；一次项C，二次项B2，交互项AB、AC、BC对芒果叶多酚的提取影响不显著.从而表明各影响因素对芒果叶多酚的影响不是简单的线性关系.还可以看出来各因素对芒果叶多酚提取的影响的大小顺序为乙醇体积分数(A)>料液比(B)>提取时间(C).

由表4可知，p值大于0.05，表明该模型差异不显著.相关系数R2=0.731 8，表明模型拟合度较差.调整确定系数R2adj=0.387 0，表明该模型能够解释38.70%的响应值的变化.用此模型来分析和预测超声提取芒果叶中的黄酮效果是可行的.从方差分析结果来看，一次项A、B、C，二次项A2、B2、C2，交互项AB、AC、BC对芒果叶黄酮的提取影响不显著.从而表明各影响因素对芒果叶黄酮的影响不是简单的线性关系.还可以看出来各因素对芒果叶多酚提取的影响的大小顺序为乙醇体积分数(A)>料液比(B)>提取时间(C).

表3 多酚响应曲面回归模型方差分析

表4 黄酮响应曲面回归模型方差分析

对实验数据进行二次多元回归拟合，所得到的二次回归方程的响应曲面图及其等高线图5、6.两组图直观的反应了乙醇体积分数对响应值的影响.

等高线图同一曲线上响应值相同，图形中心响应值最大，等高线图沿某一因素轴方向曲线密度越大，说明响应值对该因素的变化越敏感，反映在响应面上则是曲线坡度越陡峭，等高线形状趋向椭圆轴线与坐标轴的角度越大，则交互作用越明显[15].如图5、6所示，结合表的p值可知，其乙醇体积分数和料液比有显著性影响，三者之间的交互作用较小，表明各因素对芒果叶多酚含量的影响并非简单的线性关系.而对芒果叶黄酮含量的影响较小，效果不显著.

图5 乙醇提取时间与料液比对芒果叶多酚含量的响应曲面图(A)和等高线图(B)

图6 乙醇提取时间与料液比对芒果叶黄酮含量的响应曲面图(A)和等高线图(B)

2.3 芒果叶提取物的抗氧化能力

自由基是含有不成对电子的分子、原子或原子团，在生物体的新陈代谢中起着双重作用.抗氧化活性的测定具有多种机制，如清除活性氧、抑制脂质氧化等，同一种样品中会有多种抗氧化物质同时存在，在一定程度上会出现协同抗氧化作用.抗氧化活性受多种因素影响[16].本文采用DPPH、ABTS自由基的清除能力2种方法来评价芒果叶抗氧化活性的变化情况.

由图7、8可见，芒果叶提取物有一定的抗氧化能力，且随着芒果叶提取物质量浓度(ρ)的增加，样品的DPPH清除率和ABTS清除率也逐渐增加，文良娟等[17]研究了芒果叶中多酚和黄酮的抗氧化活性，发现芒果叶中多酚和黄酮对DPPH自由基具有较强的清除效果，且对于DPPH自由基的清除作用高于同等浓度的VC溶液，与本研究的结果一致，且芒果叶作为一种经济作物副产物，原料廉价易得，因此芒果叶是一种较好的天然抗氧化剂的原材料，为其在今后作为新型的食品抗氧化剂的研究开发提供了理论依据.

图7 不同质量浓度芒果叶提取物的DPPH自由基清除能力 图8 不同质量浓度芒果叶提取物的ABTS自由基清除能力

3 结语

在单因素实验的基础上，确定提取的溶剂类型，通过3因素3水平的响应曲面实验设计，对芒果叶多酚黄酮的含量进行提取优化以及其抗氧化活性的测定.结果表明，响应曲面法优化后的提取工艺为：70%乙醇、1∶20料液比(g/mL)和 30 min 提取时间.综合DPPH 和ABTS清除能力的结果，可以发现芒果叶抗氧化作用明显，是一种良好的天然抗氧化剂来源.