一种太子参环肽单体的分离制备及结构表征

贺潇宇 赵 立 魏 丹 蒋静怡 庞文生 胡 娟,2*

1.福建中医药大学药学院，福建 福州 350122；2.福建中医药大学附属第二人民医院，福建 福州 350003

环肽(Cyclic Peptide)是指氨基酸以肽键的形式连接形成的环状化合物[1]。研究结果表明环肽类化合物仅存在于一些高等植物体内存在，这些环肽结构新奇多样，骨架中除了肽键外还有酯键、醚键、二硫键等，很多环肽具有良好的生物活性，如抗菌、抗肿瘤和免疫抑制等活性[2]。环肽能够形成稳定的限制性空间构象，而且其在生物体内抗降解的能力也强于线性多肽。奇特的结构和丰富的活性使天然活性环肽成为化学家和药学家研究的热点。

太子参，系石竹科孩儿参Pseudostellariaheterophylla(Miq.)Pax ex Pax et Hoffm.的干燥块根[3]，其含有多种生物活性成分，如多糖类、环肽类、微量元素、皂苷类、挥发油类、油脂类、氨基酸类、脂肪酸类等[4]。目前已报道的太子参环肽有16种，有环八肽、环七肽、环五肽等数种大小不同的环肽[5]。本课题组建立了一种太子参环肽提取物(CPE)的制备方法，并且研究了环肽提取物抗慢性阻塞性肺病(COPD)，结果表明CPE给药组大鼠肺气道阻力急剧下降，动态肺顺应性升高。肺组织切片图像分析显示，CPE可减轻肺泡破坏程度，减轻肺组织炎症，增加肺泡间隙，改善COPD大鼠肺通气功能，这可能与其抑制TLR4-MyD88-JNK/p38通路异常激活有关[6-7]。李军等[8]发现太子参环肽HB具有酪氨酸酶抑制活性，可以用于色素沉积引起的皮肤病。

本实验利用柱层析、制备级高效液相色谱等技术，分离纯化得到一种太子参环肽单体，并对其结构进行表征，确定了该环肽的化学结构，为太子参环肽单体的分离制备提供了一种方法。

1 仪器与材料

1.1 仪器设备 Shimazu LC-8A 型制备液相色谱仪(日本岛津公司)；KQ-500DV型超声清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；电热恒温鼓风干燥箱(上海精宏实验设备有限公司)；Waters e2695高效液相色谱仪(美国Waters公司)；600Y型多功能粉碎机(永康市铂欧五金制品有限公司)；AE240s型电子分析天平(梅特勒-托利多仪器上海有限公司)；DW-86L728J超低温冰箱(青岛海尔集团)；MODULYOD-230真空冷冻干燥机(美国Thermo公司)；R-100型旋转蒸发仪(瑞士BUCHI公司)；GZY-P2D-W型超纯水机(湖南科尔顿水务有限公司)；Bruker Esquire 2000 MS(德国布鲁克公司)；Bruker AV400 NMR(德国布鲁克公司)。玻璃器皿均购于天津玻璃仪器厂。

1.2 实验材料 太子参[Pseudostellariaheterophylla(Miq.)Pax ex Pax et Hoffm.]，购于福建柘荣。甲醇(色谱纯，德国默克公司)，无水乙醇(AR，西陇化工股份有限公司)、乙酸乙酯(AR，西陇化工股份有限公司)、石油醚(AR，西陇化工股份有限公司)、环己烷(AR，西陇化工股份有限公司)、硅胶(100～200目，北京索莱宝科技有限公司)、硅胶(200～300目，北京索莱宝科技有限公司)、实验用水为电阻率为18.2 MΩ的超纯水。

2 方法与结果

2.1 太子参环肽的柱层析分离 称取干燥太子参200 g(粉碎过3号筛)，按料液比1∶8加入85%乙醇回流提取2 h，减压浓缩得乙醇浸膏。乙醇浸膏加水溶解，按体积比1∶1加入石油醚萃取3次，弃去水层，合并石油醚层。减压浓缩，浓缩液置于超低温冰箱-80 ℃预冻2 h，冷冻干燥；得石油醚萃取部位。

取石油醚萃取部位100 g，等量硅胶拌样后，600 g 硅胶(100～200目)装柱，湿法上样，以石油醚、乙酸乙酯(体积比50∶1→1∶1)系统进行梯度洗脱，每个梯度至少洗5个柱体积，每300 mL为一个馏分，经薄层色谱法定性检验，收集可能为环肽的馏分。得粗分片段，减压浓缩，浓缩液置于超低温冰箱-80 ℃预冻2 h，冷冻干燥，得粗分物粉末。

取粗分物35 g，50 g硅胶拌样，300 g硅胶(200～300目)装柱，经环己烷、乙酸乙酯(体积比100∶0→20∶1→10∶0→8∶1→5∶1)系统进行梯度洗脱，每个梯度至少洗5个柱体积，每300 mL为一个馏分,经薄层色谱法定性检验，收集可能为环肽的馏分。

2.2 太子参环肽单体的纯化 所得馏分采用制备级HPLC纯化。色谱柱为SinoChrom ODS-BP Cl8(250 mm×10 mm，5 μm)；流速5 mL/min；柱温为25 ℃；进样量1 mL。已甲醇(A)：水(B)=65∶35为流动相；检测波长203 nm。收集环肽单体峰，减压浓缩，浓缩液置于超低温冰箱-80 ℃预冻2 h，冷冻干燥，得到淡黄色粉末。

所收集环肽组分峰HPLC测定纯度。采用大连依利特Hypersil ODS2(250 mm×4.6 mm，5 μm)色谱柱；流速1mL/min；柱温25 ℃；进样量20 μL；以乙腈(A)：水(B)=10∶90为流动相，检测波长203 nm。

2.3 太子参环肽结构表征

2.3.1 MS结构表征 Bruker Esquire 2000 质谱仪进样条件：离子源：ESI；离子模式：阳离子模式；正负离子切换：关闭；扫描模式：标准/正常；质量范围50～2200 m/z；毛细出口电压：116.7 V；透镜：40.8 V；阱驱动参数：30.1；采集时间：2992 μs。

2.3.2 NMR结构表征 取所得淡环肽10 mg，溶于0.6 mL氘代DMSO中，转移至直径为5 mm的核磁管中，使用四甲基硅烷(TMS)作为内标，恒温25 ℃，由Bruker AV400 NMR测定其1H-NMR、13C-NMR、1H-1H COSY及HMBC谱图。

2.4 结果

2.4.1 太子参环肽HPLC纯度测定 所得太子参环肽单体纯度按照面积归一化法测定为95.16%，HPLC色谱图如图1所示，峰面积见表1。

表1 太子参环肽HPLC色谱数据

1.杂质峰;2.环肽峰

2.4.2 MS谱图及结构解析 由图2A可知，正离子模式的分子离子峰为m/z=502.2的[M+H]+峰；m/z=524.2的[M+Na]+峰;由图2 B可知，负离子模式下的分子离子峰为m/z=500的[M-H]-提示该环肽分子量为501.26。且正离子模式下有m/z=540.1的[M+K]+峰；m/z=474.3的[M-CO]+峰，分子量为单数,提示化合物含有奇数氮原子。表2为环肽正负离子模式下的离子峰质荷比。

表2 环肽正负离子模式下的离子峰质荷比

A.正离子模式下的环肽质谱图；B.负离子模式下环肽质谱图

2.4.3 NMR谱图及结构解析 由表3可知，1H-NMR、13C-NMR谱图中C原子、H原子的化学位值，并给出了基于HMBC、1H-1H COSY的C-H，H-H耦合关系。

表3 核磁共振波谱C、H化学位移及耦合关系归属

由图3A1H-NMR(400MHz,in DMSO)可知：高场区δ 1.25、0.77、0.95为3个甲基氢；低场区δ 8.50、7.95、7.85、7.23为氨基氢信号；δ6.63、6.93两组氢信号，为同一个苯环上的4个氢信号。由图3 B13C-NMR(400MHz,in DMSO)：该化合物含有25个碳原子，低场区有5个羰基碳信号，还有1个芳香连氧碳信号，5个芳香碳信号，且氢谱数据中有对称的芳香氢信号，提示此化合物连有1个4-羟基苯。

A.1H-NMR；B.13C-NMR

由图4 A1H-1H COSY谱图可以判断出质子间的2键、3键耦合关系；由图4 B HMBC谱图可以判断出碳原子与质子的2键、3键耦合关系，综合二维谱图推测出环肽可能含有的片段如图5所示。

A.1H-1H COSY；B.HMBC

图5 HMBC、1H-1H COSY推测可能含有的片段

综合以上NMR谱图并结合MS信息确定环肽化学结构，其分子式为C25H35N5O6，并给按照表2中的原子编号顺序给出了NMR信号归属，如图6所示。

图6 环肽化学结构

3 讨论

实验前期对太子参的提取条件进行了考察，以指纹图谱作为评价指标，确定了以85%乙醇作为提取溶剂，料液比(g/mL)为1∶8，回流提取2 h。柱层析采用湿法装柱，先在层析柱中加入少量洗脱剂，然后将洗脱剂浸泡的硅胶搅拌成匀浆后倒入层析柱中，用玻璃棒轻轻敲打柱两侧，待硅胶层沉积后，加压，赶走柱内残留的小气泡，最后用真空泵将填料抽实。

太子参环肽作为太子参的特色活性成分，具有多种药理活性，但由于含量较低，分离制备具有一定的难度，限制了太子参环肽的应用。目前，已经有较多的研究人员从指纹图谱的角度对太子参环肽进行了研究，但这些研究的重点均在于应用GC-MS、LC-MS对指纹图谱中的色谱峰进行鉴定。并没有解决目前太子参环肽单体分离制备方法不足的问题。

4 结论

通过柱层析技术分离获得环肽粗分物，经制备级HPLC纯化获得环肽单体，对其进行MS、NMR结构表征，并结合参考文献[9-10]确定其为环肽化合物Pseudostellarin A(PA)。2 kg太子参药材提取得环肽PA约65 mg，提取率(PA/药材)为32.5 μg/g，所得环肽PA纯度为95.16%。

本实验建立了一种太子参环肽PA的分离纯化方法，通过柱层析初步分离获得环肽粗分物，再经过制备级HPLC纯化获得纯度较高的PA单体，并运用现代波谱分析技术确定了环肽的化学结构，为后续太子参环肽PA药理活性研究提供了一定的基础。