组织内AEG-1表达情况对葡萄膜黑色素瘤病理特征的影响

杨晋波 郑增光 杨世峰 郑林峰

[摘要] 目的 探究組织内星形胶质细胞活化基因-1（AEG-1）表达情况对葡萄膜恶性黑色素瘤（UM）病理特征的影响。 方法 选取2016年3月～2018年8月我院眼科诊治的62例（62眼）于病理室存放的UM石蜡组织标本纳入研究组。并选取同期20例（20眼）因外部原因受伤采取眼球摘除术但少量UM或绝大部分葡萄膜组织正常的石蜡组织标本作为对照组。对比分析两组患者AEG-1基因表达情况以及AEG-1表达情况与UM病理特征的相关性。 结果 UM 组织中AEG-1 mRNA相对表达量为（1.09±0.05），正常葡萄膜膜组织中AEG-1 mRNA相对表达量为（1.01±0.12），差异有统计学意义（P<0.05）;研究组62例（62眼）AEG-1阳性表达为37眼（59.68%），阴性表达为25眼（40.32%）;对照组20例（20眼）AEG-1均呈阴性表达，差异有统计学意义（P<0.05）;肿瘤高度>8 mm、累及睫状体、侵犯巩膜导管、眼外生长、视盘受累以及继发视网膜脱落与AEG-1高表达均有明显相关性（P<0.05）。结论 UM高度>8 mm、累及睫状体、侵犯巩膜导管、眼外生长、继发视网膜脱落及视盘受累病理特征均与AEG-1的高表达具有密切联系，显著影响UM转移风险和预后，为UM临床诊断和治疗提供有效参考。

[关键词] 葡萄膜黑色素瘤;星形胶质细胞活化基因-1;基因表达;病理特征

[中图分类号] R739.7          [文献标识码] B          [文章编号] 1673-9701（2020）22-0139-04

Effect of AEG-1 expression in tissues on pathology features of uveal melanoma

YANG Jinbo   ZHENG Zengguang   YANG Shifeng   ZHENG Linfeng

Pathology Department， Zhejiang Cancer Hospital， Hangzhou   310022， China

[Abstract] Objective To explore the effect of astrocyte elevated gene-1（AEG-1） expression in tissues on pathology features of uveal melanoma（UM）. Methods Sixty-two（62 eyes） UM paraffin-embedded tissue specimens stored in the pathology room from patients treated in the department of ophthalmology in our hospital from March 2016 to August 2018 were enrolled in the research group. Twenty（20 eyes） paraffin-embedded tissue specimens from patients treated in the same period who underwent ophthalmectomy for reason of the external injury and had small amount of UM or large amount of normal uveal tissues were selected as the control group. The AEG-1 gene expression and the correlation between AEG-1 expression and pathology features of UM in the two groups were analyzed. Results It was found that the relative expression of AEG-1 mRNA in UM tissues was（1.09±0.05）， and the relative expression of AEG-1 mRNA in normal uveal tissues was（1.01±0.12）， with statistically significant differences（P<0.05）. In the research group（62 eyes）， specimens with positive expression of AEG-1 were 37（59.68%）， and specimens with negative expression of AEG-1 were 25（40.32%）; in the control group（20 eyes）， it was found that all specimens had negative expression. There were statistically significant differences in the two groups（P<0.05）. The high expression of AEG-1 was significantly correlated with tumor height>8 mm， involvement of ciliary body， invasion of sclera duct， extraocular growth， optic disc involvement， and secondary retinal detachment（P<0.05）. Conclusion The pathology features such as UM height>8 mm， involvement of ciliary body， invasion of sclera duct， extraocular growth， optic disc involvement， and secondary retinal detachment are closely related with the high expression of AEG-1， which has a significant effect on the metastasis risk and prognosis of UM， and can provide effective reference for clinical diagnosis and treatment of UM.

[Key words] Uveal melanoma; Astrocyte elevated gene-1; Gene expression; Pathology features

随着电子产品的普及，眼部疾病的发病率日益升高，其中葡萄膜恶性黑色素瘤（Uveal melanoma，UM）是一种眼睛内部的原发性恶性肿瘤，其发病率高、预后差、转移死亡率较高。占全身黑色素瘤的6%左右，严重影响人类的生命健康[1]。UM的致病原因为体内多种基因和信号传导共同作用，据研究发现[2]，星形胶质细胞活化基因-1（Astrocyte elevated gene-1，AEG-1）与多数肿瘤的发病和发展具有密切联系。AEG-1是由于人免疫缺陷病毒感染胚胎星形胶质细胞后导致其表达升高的蛋白质之一。已有研究表明，组织内AEG-1表达升高，会强化神经胶质细胞和黑色素瘤细胞的非锚定生长能力，使星形胶质细胞的抗凋亡能力增强，但其在UM中的表达情况未见详细研究[3]。因此，探讨AEG-1表达情况对UM病理特征的影响能够有效改善UM的预后，为UM治疗提供参考依据。本文就我院2016年3月～2018年8月诊治的62例葡萄膜黑色素瘤患者进行了回顾分析，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取我院2016年3月～2018年8月眼科诊治的62例（62眼）于病理室存放的UM石蜡组织标本纳入研究组。并选取同期20例（20眼）因外部原因受伤采取眼球摘除术但少量UM或绝大部分葡萄膜组织正常的石蜡组织标本作为对照组。两组患者一般临床资料比较见表1。患者年龄、性别比例和患病眼睛等指标比较，差异无统计学意义（P>0.05），具有可比性。

1.2 主要设备和试剂

兔抗人MTDH多克隆抗体ab45338购自美国Abeam公司;AEC显色试剂盒AEC-0037购自中国泰科兰薄生物技术有限公司;免疫组织化学Elivision ⅢSuper试剂盒购自福州迈新生物技术开发公司;Lipofectamine 2000转染试剂和Trizol RNA提取试剂盒购自美国Invitrogen公司;PCR扩增和逆转录等相关试剂盒购自德国Qiagen公司;AEG-1等相关引物由上海生工生物公司设计合成。

1.3 方法

1.3.1 实时荧光定量  PCR术检测两组中AEG-1 mRNA表达  选取两组患者组织，进行切碎、研磨等粉碎手段，按照要求加入适量的细胞裂解液，随后按照试剂盒说明书提取两组患者组织中的总RNA，使用分光光度计测定提取出的RNA质量和浓度。采用说明书方法将RNA逆转录为cDNA，使用实时荧光定量PCR仪按扩增试剂盒说明对引物进行扩增。加入引物序列，具体为AEG-1：上游：5'-AAG CAGTGCAAAACAGTTCACG-3'，下游：5'-GCACCTTATCACGTTACGCT-3'，扩增片段大小为121 bp;内参引物为GAODH：上游：5'-TGACTTCAACAGCGACACCC-3'，下游5' -CACCCTGTTGCTGTAGCCAAA-3'，扩增片段大小为111 bp。整个反应过程：95℃预变性30 s，95℃变性5 s，60℃退火延伸30 s，循环60次。整个过程中每个样品设置3个平行反应复孔。采用2-△△Ct法获得两组患者组织中AEG-1 mRNA相对表达量。

1.3.2 免疫组织化学检测AEG-1表达情况  将两组石蜡组织进行连续切片各5张，厚度大约为3 μm，选取1张苏木精-伊红染色进行病理诊断和相关分类，另选1张作为对照以PBS替代一抗染色，余3张进行免疫组织化学染色。染色过程：首先采用二甲苯脱蜡处理，采用梯度乙醇梯度水化，用PBS缓冲液重复冲洗3次，每次3 min。按相关试剂盒说明书要求加入pH 9.0的EDTA抗原修复液进行微波抗原修复，缓慢低速滴加3%过氧化氢溶液进行阻断，于室温条件下孵育15 min;结束后立即吸去过氧化氢溶液，且采用PBS缓冲液重复清洗3次，加入兔抗人MTDH（AEG-1）多克隆抗体一抗，比例为1：200，于4℃下过夜孵育，且PBS缓冲液重复清洗3次，每次3 min。采用HRP法进行标记，具体方法为采用兔IgG聚合物，于室温条件下孵育60 min，PBS缓冲液重复清洗3次，每次3 min;并且在所有切片上滴加新鲜配制AEC溶液，在光学显微镜下控制其显色;苏木素试剂复染5 min，采用HCl溶液分化3 s，PBS缓冲液重复清洗3次，每次3 min，水性封片剂封片。

1.3.3 免疫组织化学染色结果判定  邀請3名病理科经验丰富的专家对检测结果进行分析。参考文献[4]，以红色或粉红色着色为阳性着色于细胞核、细胞膜及细胞浆等位置进行判定。判定标准：①随机挑选每张组织切片5个或以上高倍镜视野点，统计染色细胞，评估阳性细胞数占同类细胞数的百分比情况，其中≤5%得分为0分，>5%，≤25%得分为1分;>25%，≤50%得分为2分;>50%得分为3分。②染色程度评分标准为无着色得分为0分，弱着色得分为1分，中度着色得分为2分，强着色得分为3分。最终染色结果得分=每张组织切片染色程度得分与染色细胞百分比得分之积，其中最终染色结果得分0～1分为阴性（-），得分2～3分为弱阳性（±），得分4～6分为中等阳性（+），得分>6分为强阳性（++）。本实验将阴性（-）与弱阳性（±）合记作阴性;中等阳性（+）与强阳性（++）记作阳性。

1.4 统计学方法

本研究数据采用SPSS23.0统计学软件进行分析，计数资料以[n（%）]表示，采用χ2检验，计量资料以（x±s）表示，采用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组患者AEG-1 mRNA基因表达比较

研究结果显示，UM 组织中AEG-1 mRNA相对表达量为（1.09±0.05），正常葡萄膜膜组织中AEG-1  mRNA相对表达量为（1.01±0.12），差异有统计学意义（t=4.217，P=0.000）。

2.2 AEG-1于两组组织标本中表达情况比较

据文献研究表明[5]，AEG-1被染色后一般为红色或粉红色颗粒，位置分布在UM细胞核周、细胞膜和细胞浆周围。对比分析AEG-1于两组组织标本中表达情况。本研究结果显示，研究组62例（62眼）AEG-1阳性表达为37眼（59.68%），阴性表达为25眼（40.32%）;对照组20例（20眼）AEG-1均呈阴性表达，两组相比具有显著统计学差异（P<0.05）。见表2。

2.3 AEG-1表达情况与UM病理特征相关性分析

对比分析AEG-1表达情况与UM病理特征的相关性，不同影响因素下AEG-1表达见封三图4～6。结果显示，肿瘤高度>8 mm、累及睫状体、侵犯巩膜导管、眼外生长、视盘受累及继发视网膜脱落均有明显相关性（P<0.05）。见表3。

3 讨论

UM作为成人眼部的肿瘤之一，具有转移速度快、恶性程度高、发病率高及预后差等特点，严重影响患者的生命健康。据研究发现，因其转移风险尚未明确，且转移较为隐匿，早期不易被发现，其死亡率高达50%[6]。因此，需对影响UM患者预后的相关因素进行进一步分析。近年来，有学者[7]调研发现，AEG-1为引发肿瘤细胞侵袭、抗凋亡和转移的蛋白质之一，其中，AEG-1在UM中高表达，且与UM的预后具有相关性，但其与UM病理特征的相关性尚未有明确定论。

肿瘤的发生及发展是因为打破了细胞增生和凋亡之间的动态平衡所导致的，一旦体内细胞凋亡受到阻碍或是无限增生出现问题，即发生肿瘤[8]。在UM中存在着大量抗细胞凋亡的基因和相应参与调节的基因，AEG-1为其一。本研究采用PCR技术对比UM组织和正常葡萄膜组织中AEG-1 mRNA表达量，结果显示，UM 组织中AEG-1 mRNA相对表达量为（1.09±0.05），正常葡萄膜膜组织中AEG-1 mRNA相对表达量为（1.01±0.12），两组具有显著的统计学差异（P<0.05）。该研究表明，AEG-1在正常葡萄膜组织中mRNA表达量显著小于UM组织中，且在UM中呈现为高表达，与文献结果一致[9]。另外，有相关研究认为[10]，AEG-1作为肿瘤生物标记物，其于视网膜母细胞瘤和神经母细胞瘤中普遍呈現高表达状态，与本研究结果一致。本文证实AEG-1高表达与是否出现继发视网膜脱落具有显著相关性（P<0.05）。此外，本文探究组织内AEG-1表达情况对UM的病理特征的影响，结果显示，AEG-1的表达情况与UM的预后具有密切关联，与上述结果一致。首先，研究发现年龄、性别比例、患病眼睛、肿瘤直径和肿瘤类型等指标比较均未见明显统计学差异（P>0.05），与文献结果不一致[11]。其他相关研究结果得出高龄、肿瘤直径和肿瘤细胞类型与UM患者存在一定的相关性，导致该结果的原因为本研究样本量过小。同时，为分析AEG-1于UM中的表达情况与其临床病理特征的相关性，将肿瘤高度、是否累及睫状体、是否侵犯巩膜导管、是否眼外生长、是否继发视网膜脱落以及视盘是否受累等因素进行对比分析。结果表明，当肿瘤高度>8 mm时，肿瘤细胞转移率相较于≤8 mm细胞更高，且AEG-1阴性表达率明显较高（P<0.05），相关文献结果一致[12]。该结果证实肿瘤细胞高度影响AEG-1阳性表达，并且随着肿瘤高度的增加，转移风险增大。当葡萄膜黑色素瘤扩散至睫状体时，多数患者存在虹膜新生血管生成情况，其会导致肿瘤转移风险不断增加[13-15]。本研究结果显示，是否累及睫状体与AEG-1表达情况具有密切联系，且具有显著统计学差异（P<0.05）。由此证明，AEG-1在UM组织中高表达与肿瘤累及睫状体相关性显著，且与其转移风险相关。另外，UM按照其病理细胞形态被分为上皮样细胞性、混合细胞型和上皮样或混合细胞型三种，相关研究发现[16-18]，混合细胞型的预后与上皮样细胞的比例具有联系，且AEG-1表达与UM细胞类型具有显著相关性，该结果与本文结果不同。表明本研究因样本量较小具有一定的局限性，后期需扩大样本量作进一步证实。本研究结果显示，肿瘤细胞眼外生长亦为影响肿瘤转移的影响因素，出现该现象的原因为肿瘤细胞生长于眼外，易通过血管和淋巴管，亦或是直接扩散到体内其他器官，导致肿瘤转移风险加大[19-20]。本文对AEG-1表达情况与是否眼外生长进行相关性分析，结果发现两者显著相关（P<0.05）。由此说明，肿瘤眼外生长不仅与AEG-1高表达相关，且影响UM预后。

综上所致，UM肿瘤高度>8 mm、累及睫状体、侵犯巩膜导管、眼外生长、继发视网膜脱落及视盘受累均与AEG-1的高表达具有显著的相关性，明显影响UM转移风险和预后，为UM临床诊断和治疗提供有效参考。但由于本研究样本量有限，且并未对AEG-1是否改变UM生物学行为和相关其他基因表达进行深入研究，因此，今后仍需采用生物学实验对本研究结果进行证实。

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（收稿日期：2019-10-30）