威灵仙总皂苷对类风湿关节炎大鼠外周血T 淋巴细胞亚群的影响

燕丽君, 佟胜全, 刘 静, 高冬梅, 吴 萍, 王 茜

（河北医科大学附属唐山工人医院风湿免疫科，河北 唐山 063000）

类风湿性关节炎（rheumatoid arthritis， RA）是临床常见慢性病，致残率高，在我国RA 患病率约为0.4%［1］。RA 发生的主要原因是机体免疫平衡被破坏， 导致细胞炎性因子如白细胞介素1β（interleukin-1β， IL-1β） 、 白 细 胞 介 素 6（interleukin-6， IL-6） 和肿瘤坏死因子α （tumor necrosis factor-α，TNF-α） 等比例失衡［2］。目前临床对RA 的治疗药物以TNF-α 等生物制剂为主，以抑制机体炎症反应为目的，缓解症状，减少关节损伤［3］，但生物制剂只能缓解关节疼痛，且有明显不良反应，长期使用容易导致机体免疫能力失衡［4］。中医学研究［5］显示：RA 的主要病机是机体感受风寒湿邪所致的病邪阻滞经络、气血运行不畅。对此，治疗上应以祛风除湿和通络止痛为主。威灵仙为治风湿痹痛之要药，主要用于治疗风湿痹痛、筋脉拘挛和关节活动不利［6］。 威灵仙总皂苷（total saponins of clematis， TSC） 是从威灵仙中提取的有 效 成 分。研 究［7］表 明：TSC 能 通 过 抑 制T 淋 巴细胞的过度增殖、抑制细胞因子和前列腺素E2 而发挥抗RA 作用。 目前国内外尚未见有关TSC对T 淋巴细胞亚群影响的研究报道。本研究建立RA 大鼠模型，观察TSC 对RA 大鼠外周血T 淋巴细胞亚群和血清炎性因子水平的影响，为RA 的防治与新药开发提供依据。

1 材料与方法

1.1实验动物、主要试剂和仪器SD 大鼠50 只，雄性，8 周龄，体质量190～230 g，购自河北省实验动物中心， 动物使用许可证号： SYXK （冀）2018-008。饲养条件：室温22℃～25 ℃，相对湿度45%～65%，自由饮水和摄食，适应性饲养1 周。TSC 由中国药科大学中药学院药剂教研室提供，总皂苷构成比为65% （UV 法）；牛Ⅱ型胶原蛋白、弗氏完全佐剂（freund complete adjuvant， FCA）和弗氏不完全佐剂（freund incompIete adjuvant，FIA） 购自上海艾研生物科技有限公司；PE 抗大鼠CD4 和FITC 抗大鼠CD8 购自美国BD 公司；TNF-α、IL-1β 和IL-6 ELISA 试剂盒购自上海奥生物科技有限公司。FACSCanto Ⅱ流式细胞仪购自美国BD 公司，HBS-1101 酶标仪购自南京铁德实验设备有限公司。

1.2动物模型的建立和分组参照参考文献［8］方法， 取1 g·L－1FCA 1.5 mL ， 加 入 等 体 积2 g·L－1胶原溶液（采用0.05 mmol·L－1醋酸溶解）。于30 000 r·min－1搅拌混合3 min 形成稳定的乳液。采用注射器从大鼠尾根部2 cm 处注射0.1 mol·L－1乳剂。10 d 后于尾根部3 cm 处注射胶原和不完全佐剂的混合乳剂0.05 mL 加强免疫。造模成功标准［9］：大鼠24 h 内足部出现急性炎性反应肿胀，48 h 内继发全身多发性关节炎，表现出大鼠前肢或侧肢出现明显肿胀，且耳部、尾部或出现炎性结节。将建模成功的40 只大鼠随机分为模型组和低、中及高剂量TSC组，每组10只，另取10只大鼠作为对照组，给予等量生理盐水代替乳剂。

1.3给药方法建模次日给予TSC 干预，低、中和高剂量TSC 组大鼠分别灌胃50 、 100 和200 mg·kg－1TSC，模型组和对照组大鼠给予等体积生理盐水，连续给药6 周。

1.4各组大鼠踝关节肿胀度和关节炎指数测定采用游标卡尺测量造模前后和给药前后大鼠左后足踝关节厚度，计算踝关节肿胀度。踝关节肿胀度=给药后（造模后） 踝关节厚度－给药前（造模前）踝关节厚度。采用5 级评分法［10］评定大鼠四肢关节炎指数，根据踝关节肿胀情况分为0～4 分，肿胀度≤5% 计为0 分；5%＜肿 胀 度≤15% 计 为1 分； 15%＜肿胀度≤30% 计为2 分；30%＜肿胀度≤60% 计为4 分；肿胀度＞60% 计为4 分，分数越高表示肿胀程度越严重。

1.5流式细胞术检测各组大鼠外周血CD4+T淋巴细胞、CD8+T淋巴细胞百分率和CD4+/CD8+T淋巴细胞比值给药6 周后，取大鼠眼眶静脉血，经EDTA 抗凝处理，分离外周血单个核细胞，调整细胞悬液至细胞个数为5×106μL－1。取100 μL 细胞悬 液， 加 入10 μL CD3+/CD4+/CD8+复 合 抗 体及2 mL 细 胞 裂 解 液， 静 置10 min， 采 用PBS 洗涤，置于1 000 r·min－1离心4 min，弃上清，加入PBS 洗涤，滤模过滤后加入Buffer 缓冲液300 μL，避光处理30 min，采用流式细胞仪检测各组大鼠外周血CD4+T 淋巴细胞和CD8+T 淋巴细胞百分率，并计算CD4+/CD8+T 淋巴细胞比值。

1.6 ELISA法检测各组大鼠血清TNF-α、IL-1β和IL-6水平给药6 周后，取大鼠眼眶静脉血，分离取血清，按照ELISA 试剂盒说明书检测大鼠血清TNF-α、IL-1β 和IL-6 水平。

1.7计算各组大鼠脾脏指数各组大鼠称质量后，处死大鼠，摘取脾脏，称脾脏质量，计算脾脏指数。脾脏指数=脾脏质量（g）/大鼠质量（g）×100%。

1.8统计学分析采用SPSS 19.0 统计软件进行统计学分析。各组大鼠踝关节肿胀度，关节炎指数、外周血CD4+T 淋巴细胞和CD8+T 淋巴细胞百分率，血清TNF-α、IL-1β 和IL-6 水平以及脾脏指数均符合正态分布，以x±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用独立样本t检验。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1各组大鼠治疗前后踝关节肿胀度和关节炎指数与给药前比较，给药后低、中和高剂量TSC组大鼠踝关节肿胀度和关节炎指数均明显降低（P＜0.05）；治疗后，与模型组比较，低、中和高剂量TSC组大鼠踝关节肿胀度和关节炎指数均明显降低（P＜0.05）；中和高剂量TSC组大鼠踝关节肿胀度和关节炎指数均明显低于低剂量TSC组（P＜0.05）；高剂量TSC组大鼠踝关节肿胀度和关节炎指数均明显低于中剂量TSC 组（P＜0.05）。见表1。

表1 各组大鼠踝关节肿胀度和关节炎指数Tab.1 Ankle swelling degrees and arthritis indexes of rats in various groups (n=10,x±s)

2.2各组大鼠外周血CD4+淋巴细胞和CD8+T淋巴细胞百分率与对照组比较，模型组大鼠外周血CD4+T 淋巴细胞百分率和CD4+/CD8+T 淋巴细胞比值均明显升高（P＜0.05），CD8+T 淋巴细胞百分率明显降低（P＜0.05）； 与模型组比较， 低、中和高剂量TSC 组大鼠外周血CD4+T 淋巴细胞百分率和CD4+/CD8+T 淋巴细胞比值均明显降低（P＜0.05）， CD8+T 淋巴细胞百分率明显升高（P＜0.05）； 与低剂量TSC 组比较， 中和高剂量TSC 组大鼠外周血CD4+T 淋巴细胞百分率和CD4+/CD8+T 淋巴细胞比值均明显降低（P＜0.05）， CD8+T 淋巴细胞百分率明显升高（P＜0.05）；与中剂量TSC 组比较，高剂量TSC 组大鼠外周血CD4+/CD8+T 淋巴细胞比值明显降低（P＜0.05）。见表2 和图1。

表2 各组大鼠外周血CD4+T 淋巴细胞和CD8+T 淋巴细胞百分率Tab.2 Percentages of CD4+ T lymphocytes and CD8+ T lymphocytes in peripheral blood of rats in various groups(n=10,x±s, η/%)

图1 各组大鼠血清T 淋巴细胞亚群流式细胞图Fig.1 Flow cytometry diagram of serum T lymphocyte subgroups of rats in various groups

2.3各组大鼠血清TNF-α、IL-1β和IL-6水平与对照组比较，模型组大鼠血清TNF- α、 IL-1β 和IL-6 水平明显升高（P＜0.05）； 与模型组比较，低、中和高剂量TSC 组大鼠血清TNF-α、IL-1β 和IL-6 水平明显降低（P＜0.05）；与低剂量TSC 组比较，中和高剂量TSC 组大鼠血清TNF-α、IL-1β和IL-6 水平明显降低（P＜0.05）；与中剂量TSC组比较， 高剂量TSC 组大鼠血清TNF-α、 IL-1β 和IL-6 水平明显降低（P＜0.05）。见表3。

2.4各组大鼠脾脏指数与对照组比较，模型组大鼠脾脏指数明显升高（P＜0.05）；与模型组比较，低、中和高剂量TSC 组大鼠脾脏指数明显降低（P＜0.05）。低、中和高剂量TSC 组大鼠脾脏指数比较差异无统计学意义（P＞0.05）。见图2。

3 讨 论

RA 属于自身免疫性疾病， 由机体中反应性T 淋巴细胞介导，导致炎性反应的发生，常表现为关节损伤。中医学研究［11］认为：RA 属于 “痹病” 范畴，常采用祛风通络的方法防治。威灵仙来源于毛茛科植物威灵仙Clematis chinensisOsbeck.棉团铁线莲C.hexapetala pall.或 东 北 铁 线 莲C.mandshuricaRupr.的根和根茎，对治疗自身免疫性疾病具有显著疗效，被列为RA 治疗的常用药物。TSC 是威灵仙的主要成分，夏伦祝等［12］研究表明：TSC 能够抑制细胞因子IL-1、IL-6、IL-8 和TNF-α 水平，起抗炎作用。Ⅱ型胶原诱导性关节炎（collagen-induced arthritis， CIA） 模型是一种免疫性炎症模型，研究［13-14］表明：CIA 模型在临床表现、病理学和免疫学改变等方面均与人类RA的临床特征相似，因此被广泛应用于RA 的研究。本研究结果显示：与模型组比较，低、中和高剂量TSC 组大鼠踝关节肿胀度和关节炎指数明显降低，说明不同剂量TSC 均能有效减轻RA 引起的症状。

表3 各组大鼠血清TNF-α、IL-1β 和IL-6 水平Tab.3 Levels of TNF-α，IL-1β, and IL-6 in serum of rats in various groups [n=10,x±s,ρB/(μg·L－1)]

图2 各组大鼠脾脏指数Fig.2 Spleen indexes of rats in various groups

T 淋巴细胞是机体免疫系统中最重要的细胞群，包括CD4+辅助性T 淋巴细胞和CD8+细胞毒性T 淋巴细胞亚群，T 淋巴细胞亚群间相互作用，CD4+/CD8+T 淋巴细胞比值可反映机体的免疫平衡 状 态。研 究［15-16］表 明：CD4+/CD8+T 淋 巴 细 胞比值失衡是RA 发病的重要影响因素。本研究结果表明：模型组大鼠CD4+/CD8+T 淋巴细胞比值明显高于对照组，CD4+/CD8+T 淋巴细胞比值升高说明CD8+T 淋巴细胞百分率的减少对B 淋巴细胞作用减弱，CD4+T 淋巴细胞百分率增加对B 淋巴细胞的辅助作用增强，从而导致B 淋巴细胞激活，产生大量自身抗体，从而引起免疫复合物沉积在关节局部，引起关节损伤。T 淋巴细胞介导的免疫反应分为T 淋巴细胞特异性抗原识别、T 淋巴细胞的活化、T 淋巴细胞增殖及分化和效应T 淋巴细胞发挥效应功能4 个阶段，其中抗原识别与T 细胞活化是该免疫反应中的关键环节［17］。在RA 发病过程中，T 淋巴细胞活化后直接调控巨噬细胞、树突状细胞、滑膜细胞和破骨细胞释放各种细胞炎性因子，最终导致炎症持续和骨质破坏［18-19］。TNF-α、IL-6 和IL-1β 是参与调节机体免疫应答的重要炎症细胞因子，在正常机体免疫应答反应过程中，能够通过复杂的免疫调节使机体表现出抗感染和改善免疫状态等功能［20-21］。本研究结果表明：模型组大鼠血 清TNF-α、IL-6 和IL-1β 水 平 明 显 高 于 对 照 组，说 明 在RA 发 生 发 展过 程 中， TNF- α 、 IL-6 和IL-1β 等细胞炎性因子的表达水平明显升高，呈过表达状态，导致机体T 淋巴细胞功能紊乱，容易加重滑膜细胞及滑膜组织中性粒细胞浸润，加剧关节损伤［22-24］。本研究中，RA 模型大鼠给予低、中和高剂量TSC 干预后，RA 模型大鼠外周血CD4＋T淋巴细胞百分率明显降低，CD8＋T 淋巴细胞百分率明显升高，CD4＋/CD8＋T 淋巴细胞比值明显降低，TNF-α、IL-1β 和IL-6 水平明显降低，脾脏指数明显降低，说明不同剂量TSC 能够有效调节机体免疫平衡，调节T 淋巴细胞亚群平衡，降低细胞炎性因子分泌。在T 淋巴细胞活化过程中，细胞表面一些活化分子如CD69 以及Th1/Th2 和Tcl/Tc2 细胞亚群也发生了变化［23-24］。这些分子在静息状态下很少在T 淋巴细胞上表达，因此可作为判断药物对RA 疗效的指标， 但该结论有待进一步探讨。

综 上 所 述， TSC 可 通 过 调 节 CD4+和CD8+T 淋巴细胞百分率， 抑制炎性细胞因子分泌，减轻RA 症状，对RA 起到抑制作用。