雷公藤内酯醇对类风湿性关节炎模型大鼠血管新生和PTEN/PI3K/AKT 通路的影响

刘 静, 燕丽君

（河北医科大学附属唐山工人医院风湿免疫科，河北 唐山 063000）

中医认为类风湿性关节炎的发生与营卫和风寒湿有关，多采用活血养阴、扶正祛邪及祛风除湿等中药治疗方法［1］。雷公藤为治疗类风湿性关节炎疗效比较显著的中药，具有通络止痛、祛风除湿、解毒杀虫和消肿止痛等功效［2］，雷公藤内酯醇为其有效成分，具有抗炎和免疫抑制作用［3］。研究［4］显示：雷公藤内酯醇在类风湿性关节炎中发挥作用，但其作用机制尚不清楚。本研究探讨雷公藤内酯醇对类风湿性关节炎大鼠血管新生和第10 号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源物基因/磷酸肌醇-3-激酶/蛋白激酶B （phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten/phosphoinositide-3-kinse/protein kinase B， PTEN/PI3K/AKT） 通 路的影响，分析雷公藤内酯醇治疗类风湿性关节炎的可能机制。雷公藤内酯醇在类风湿性关节炎中具有抗炎作用，但其作用机制尚不清楚，本研究从作用机制方面探讨雷公藤内酯醇在类风湿性关节炎治疗中的作用。

1 材料与方法

1.1实验动物、主要试剂和仪器雄性、清洁级、健康、SD 大鼠80 只，体质量150～170 g、购自北京市医疗器械检验所，动物使用许可证号：SYXK（京） 2015-0005。雷公藤内酯醇（中国药品生物制品鉴定所），双氯芬酸钠缓释片（北京诺华制药有限公司），弗氏完全佐剂（美国Sigma 公司），微血管密度（microvessel density， MVD） 和血管内皮生 长 因 子 （vascular endothelial growth factor，VEGF） 酶 联 免 疫 吸 附 试 验 （enzyme linked immunosorbent assay ， ELISA） 试 剂 盒（ 美 国Bioworld 公司），山羊抗鼠CD31 多克隆抗体、兔抗鼠VEGF 多克隆抗体、兔抗鼠PTEN 单克隆抗体、兔抗鼠PI3K 单克隆抗体、兔抗鼠AKT 单克隆抗体和兔抗鼠磷酸化AKT （p-AKT） 单克隆抗体等抗体（美国Santa cruz 公司）。酶标仪（美国Bio-Rad公司）。

1.2动物分组和模型制备将80 只大鼠随机分为对照组、模型组、 治疗组和阳性药物组， 每组20 只。除对照组外，其余各组均建立类风湿性关节炎模型。建模方法：将15 mg Ⅱ型胶原（Col Ⅱ）溶于7.5 mL 浓度为0.1 mol·L－1的醋酸中，唾液充分溶解；第2 天在冰浴中与弗氏完全佐剂等体积混合， 充分乳化制成15 mL 乳化剂， 置于冰箱中4℃保存。在大鼠左后肢足趾皮内注射0.1 mL 乳化剂致炎，第7 天在大鼠尾部和背部多点皮内注射0.1 mL 乳化剂激发；对照组相同部位相同方法注射等量生理盐水；大鼠左足明显红肿和体积增大表明造模成功［5］。

1.3给药方法造模2 周后，剔除造模不成功大鼠，纳入实验大鼠：对照组大鼠20 只（无死亡）、模型组大鼠17 只（造模过程中死亡2 只，造模不成功1 只）、治疗组大鼠19 只（造模不成功1 只，无死亡大鼠） 和阳性药物组大鼠18 只（死亡1 只，造模不成功1 只）。治疗组大鼠给予雷公藤内酯醇灌胃（6 mg·kg－1），每天灌胃1 次［6］；阳性药物组大鼠给予双氯芬酸灌胃（10 mg·kg－1）， 每天灌胃1 次； 模型组和对照组大鼠给予等量生理盐水灌胃，每天灌胃1 次，共3 周。治疗后，观察各组大鼠精神状态、进食量和活动情况等一般状态；采用天平秤称取各组大鼠体质量；采用细角圆规和毫米直尺测定各组大鼠足爪厚度；采用关节炎评分法（0～4 级） 评估关节炎指数积分：无红肿为0 分，趾关节红肿为1 分，趾关节和足趾肿胀为2 分，踝关节以下足爪肿胀为3 分，包括踝关节的全部足爪肿胀为4 分。四肢关节炎指数积分之和为每只大鼠关节炎指数积分，最高分为16 分［7］。

1.4标本采集治疗结束后，水合氯醛腹腔麻醉大鼠，断头处死； 断头时抽取5 mL 大鼠全血，1 000 r·min－1离心15 min，留取血清用于ELISA 检测；断头后立即剪取双侧踝关节，将皮毛、肌肉和筋膜剔除，将踝关节滑膜组织分为两部分，一部分置于甲醛中固定24 h，加入脱钙液脱钙1 周，加入硫代硫酸钠溶液中和3 h，乙醇逐级脱水，石蜡包埋，切成厚5 μm 切片用于HE 和免疫组织化学染色； 另一部分关节滑膜组织置入液氮中， 用于Western blotting 检测。

1.5 HE染色检测各组大鼠关节滑膜组织病理形态表现将关节滑膜石蜡切片置于烤箱中烤干，采用二甲苯脱蜡，经乙醇水化；进行常规HE 染色：置入苏木精中染色15 min，盐酸乙醇分化30 s，置入伊红中染色3 min；梯度酒精脱水，封固，光镜下观察滑膜组织病理形态表现。

1.6免疫组织化学法检测各组大鼠关节滑膜组织中MVD和VEGF表达水平取石蜡组织脱蜡水化，置于EDTA 抗原修复缓冲液中修复抗原，加入过氧化氢溶液孵育15 min 阻断内源性过氧化物酶，置于PBS 液中脱色摇床洗涤，加入兔血清封闭30 min，加入一抗：山羊抗鼠CD31 多克隆抗体（1∶100）、兔抗鼠VEGF 多克隆抗体（1∶200），过夜孵育，加入二抗孵育1 h，加入DAB 显色液显色，苏木精复染，盐酸酒精分化，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，显微镜下观察并采集图像。滑膜组织中被染色成棕黄色、与周围组织明显分开的内皮细胞族为单个微血管；在200 倍视野下， 采用Image-Pro Plus6.0 软件计算微血管个数及组织面积， MVD= 微血管个数/组织面积（mm－2）。VEGF 免疫组织化学染色结果判定标准：细胞核和细胞浆被染成棕黄色为VEGF 阳性细胞，200 倍视野下拍照观察细胞染色情况， 采用Image-Pro Plus6.0 软件分析阳性细胞的累积吸光度（IA） 值。

1.7 ELISA法检测各组大鼠血清VEGF水平取各组大鼠血清，采用双抗体夹心ELISA 法检测各组大鼠血清VEGF 水平，操作步骤按说明书进行，测量波长450 nm 处A 值，绘制标准曲线，以A 值代表血清VEGF 水平。

1.8 Western blotting法检测各组大鼠滑膜组织中PTEN、PI3K、AKT和p-AKT蛋白表达水平取约100 mg 滑膜组织，加入裂解液提取总蛋白，采用Bradford 法测定组织蛋白浓度，制备SDS-PAGE 凝胶， 取50 μg 蛋白上样， 80 V 恒压电泳， 湿法转膜，脱脂奶粉封闭1 h，加入一抗：兔抗鼠PTEN单克隆抗体（1∶1 000）、兔抗鼠PI3K 单克隆抗体（1∶200）、兔抗鼠AKT 单克隆抗体（1∶1 000）、兔抗鼠p-AKT 单克隆抗体（1∶1 000）， 过夜孵育；加入二抗（1∶5 000） 孵育1 h，显影、曝光后， 采用Image-Pro Plus 6.0 软件分析条带灰度值，以β-actin 为内参照，计算目的蛋白表达水平。目标蛋白表达水平=目标蛋白条带灰度值/β-actin条带灰度值。

1.9统计学分析采用SPSS 20.0 统计软件进行统计学分析。各组大鼠体质量、足爪厚度、关节炎指数积分，大鼠关节滑膜组织中MVD 和VEGF 表达水平和血清VEGF 表达水平，关节滑膜组织中PTEN、PI3K、AKT 和p-AKT 蛋白表达水平经F检验显示方差齐性，以±s表示，多组间样本均数比较采用单因素方差分析，组内两两比较采用LSD 检验，类风湿性关节炎大鼠足爪厚度、关节炎指数、 MVD 与其他指标的相关性分析采用Person 相关分析法。 以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1各组大鼠一般情况对照组大鼠饮食和活动等无明显异常；模型组大鼠食欲减退、体质量增加缓慢、活动量减少、行动迟缓；阳性药物组和治疗组大鼠饮食和活动较模型组明显改善。

2.2各组大鼠体质量、足爪厚度和关节炎指数积分与对照组比较，模型组大鼠体质量降低（P＜0.05）， 足爪厚度升高（P＜0.05）； 与模型组比较， 阳性药物组和治疗组大鼠体质量升高（P＜0.05），足爪厚度降低（P＜0.05），关节炎指数积分降低（P＜0.05）。见表1。

表1 各组大鼠体质量、足爪厚度和关节炎指数积分Tab.1 Body weights, paw thickness and arthritis index scores of rats in various groups （± s）

表1 各组大鼠体质量、足爪厚度和关节炎指数积分Tab.1 Body weights, paw thickness and arthritis index scores of rats in various groups （± s）

“ － ”： No data.*P＜0.05 compared with control group ；Δ P＜0.05 compared with model group.

Group Control Model Positive drug Treatment FP n 20 17 18 19 Body weight（m/g）10.84±0.92 8.11±0.87*9.10±0.86Δ 9.02±0.91Δ 30.881 0.000 Paw thickness（l/mm）5.78±0.24 8.65±0.33*6.93±0.31Δ 6.91±0.28Δ 302.636 0.000 Arthritis index score－7.32±0.94 6.38±0.92Δ 6.47±0.89Δ 5.591 0.006

2.3各组大鼠滑膜组织形态表现对照组大鼠滑膜组织未见异常；模型组大鼠滑膜组织见大量新生血管和炎症细胞浸润、滑膜组织增生；阳性药物组和治疗组大鼠滑膜组织新生血管和炎症细胞数减少，其中治疗组大鼠滑膜组织新生血管和炎症细胞数减少更明显。见图1 （插页七）。

2.4各组大鼠滑膜组织中MVD 与对照组比较，模型组大鼠滑膜组织中MVD 升高（P＜0.05）；与模型组比较，治疗组和阳性药物组大鼠滑膜组织中MVD 降低（P＜0.05）；与阳性药物组比较，治疗组大鼠滑膜组织中MVD 降低（P＜0.05）。见图2（插页七） 和表2。

表2 各组大鼠滑膜组织中MVD 和VEGF 表达水平Tab.2 MVD and expression levels of VEGF in synovial tissue of rats in various groups （± s）

表2 各组大鼠滑膜组织中MVD 和VEGF 表达水平Tab.2 MVD and expression levels of VEGF in synovial tissue of rats in various groups （± s）

*P＜0.05 Compared with control group；ΔP＜0.05 compared with model group；＃P ＜0.05 compared with positive drug group.

Group Control Model Positive drug Treatment FP n 20 17 18 19 MVD（S/mm－2）9.35±1.02 104.36±3.57*66.29±3.18Δ 48.77±3.25Δ#3431.055 0.000 VEGF 18.21±1.97 143.24±2.76*96.35±2.64Δ 81.02±2.51Δ#8125.035 0.000

2.5各组大鼠滑膜组织中VEGF表达水平与对照组比较，模型组大鼠滑膜组织中VEGF 表达水平升高（P＜0.05）；与模型组比较，阳性药物组和治疗组大鼠滑膜组织中VEGF 表达水平降低（P＜0.05）；与阳性药物组比较，治疗组大鼠滑膜组织中VEGF 表达水平降低（P＜0.05）。 见图3（插页七） 和表2。

2.6各组大鼠血清VEGF水平与对照组比较，模型组大鼠血清中VEGF 水平升高（P＜0.05）；与模型组比较， 阳性药物组和治疗组大鼠血清VEGF 水平降低（P＜0.05）；与阳性药物组比较，治疗组大鼠血清VEGF 水平降低（P＜0.05）。见表3。

2.7各组大鼠滑膜组织中PTEN/PI3K/AKT通路相关蛋白表达水平与对照组比较，模型组大鼠滑膜组织中PTEN 蛋白表达水平降低（P＜0.05），PI3K、 AKT 和p-AKT 蛋白表达水平升高（P＜0.05）；与模型组比较，阳性药物组和治疗组大鼠滑膜组织PTEN 蛋白表达水平升高（P＜0.05），PI3K、 AKT 和p-AKT 蛋白表达水平降低（P＜0.05）；与阳性药物组比较，治疗组大鼠滑膜组织中PTEN 蛋白表达水平升高（P＜0.05）， PI3K、AKT 和p-AKT 蛋白表 达水平 降低（P＜0.05）。见图4 和表4。

表3 各组大鼠血清VEGF 水平Tab.3 Levels of serum VEGF of rats in various groups[±s,ρB/(ng·L－1）]

表3 各组大鼠血清VEGF 水平Tab.3 Levels of serum VEGF of rats in various groups[±s,ρB/(ng·L－1）]

*P＜0.05 compared with control group；ΔP＜0.05 compared with model group；＃P＜0.05 compared with positive drug group.

Group Control Model Positive drug Treatment FP n 20 17 18 19 VEGF 38.67±4.21 73.26±4.85*53.24±4.98Δ 46.23±5.02Δ＃174.773 0.000

图4 Western blotting 法检测各组大鼠滑膜组织中PTEN、PI3K、AKT 和p-AKT 蛋白表达电泳图Fig.4 Electrophoregram of expressions of PTEN, PI3K,AKT , and p - AKT proteins in synovial tissue of rats in various groups detected by Western blotting method

2.8类风湿性关节炎大鼠足爪厚度、关节炎指数和MVD与其他指标的相关性类风湿性关节炎大鼠的足爪厚度和关节炎指数与VEGF 及p-AKT 呈正相关关系（P＜0.05）， 与PTEN 呈负相关关系（P＜0.05）；MVD 与VEGF、PI3K 和p-AKT 呈正相关关系（P＜0.05）， 与PTEN 呈负相关关系（P＜0.05）。见表5。

3 讨 论

类风湿性关节炎的主要表现为关节滑膜炎症，为一种全身性、慢性、自身免疫性疾病，其病理特点为滑膜增生、血管翳形成和多种炎症细胞浸润，最终引起骨质破坏和关节畸形等［8］。滑膜新生的血管翳是类风湿性关节炎滑膜增生、关节软骨损害和周围组织损害的主要因素［9］，抑制滑膜组织血管新生是治疗类风湿性关节炎的途径之一。

本研究采用雷公藤内酯醇治疗类风湿性关节炎模型大鼠发现：治疗组大鼠足爪厚度和关节炎指数积分降低，滑膜组织新生血管和炎症细胞减少，滑膜组织中MVD 降低，滑膜组织和血清中VEGF 表达水平降低。血管新生在类风湿性关节炎早期和活动期比较活跃，滑膜血管新生的发生与多种因子关系密切，VEGF 为最具内皮特异性的一种生长因子，可促进血管新生，参与多种疾病的发生发展过程［10］；VEGF 与其受体相互作用在类风湿性关节炎血管翳形成、软骨和骨组织的破坏中发挥重要作用，其水平升高表明血管新生增加［11］。在西医水平目前尚无确切的靶向治疗药物。中医认为［12］活动期类风湿性关节炎的主要病因病机为风寒湿邪入侵，导致气血壅滞不通、痹阻脉络，从而出现关节红肿疼痛，故认为湿热淤阻是活动期类风湿性关节炎病机的关键。雷公藤具有祛风除湿、消肿止痛、清热解毒和活血通络等功效［13］，雷公藤内酯醇作为雷公藤的主要有效成分，也具有雷公藤的祛风除湿、 消肿止痛、 清热解毒和活血通络等功效［14］。故分析雷公藤内酯醇在类风湿性关节炎中通过祛风除湿、消肿止痛、清热解毒、活血通络发挥消除关节红肿疼痛的功效［15］；研究［16］显示：雷公藤内酯醇具有抑制血管生长的作用，故本研究中雷公藤内酯醇治疗类风湿性关节炎的机制可能与其可抑制血管新生有关联。与阳性药物双氯芬酸钠比较，雷公藤内酯醇治疗类风湿性关节炎的效果与双氯芬酸钠相当，但其抑制血管新生的作用优于双氯芬酸钠，表明雷公藤内酯醇可能通过抑制血管新生发挥对类风湿性关节炎的治疗作用。

表4 各组大鼠滑膜组织中PTEN/PI3K/AKT 通路相关蛋白表达水平Tab.4 Expression levels of PTEN, PI3K, AKT ，and p-AKT proteins in synovial tissue of rats in various groups （± s）

表4 各组大鼠滑膜组织中PTEN/PI3K/AKT 通路相关蛋白表达水平Tab.4 Expression levels of PTEN, PI3K, AKT ，and p-AKT proteins in synovial tissue of rats in various groups （± s）

*P＜0.05 compared with control group；ΔP＜0.05 compared with model group；＃P＜0.05 compared with positive drug group.

Group Control Model Positive drug Treatment FP n 20 17 18 19 PTEN 0.96±0.15 0.37±0.11*0.52±0.14Δ 0.83±0.15Δ＃70.187 0.000 PI3K 0.09±0.03 0.73±0.12*0.69±0.11Δ 0.35±0.08Δ＃211.478 0.000 AKT 0.08±0.02 0.43±0.05*0.39±0.03Δ 0.17±0.06Δ＃291.861 0.000 p-AKT 0.08±0.03 0.47±0.09*0.36±0.04Δ 0.22±0.05Δ＃169.944 0.000

表5 类风湿性关节炎大鼠的足爪厚度、关节炎指数和MVD与其他指标的相关性Tab.5 Correlations between paw thickness, arthritis index,MVD and other indexes of rats with rheumatoid arthritis

本研究结果显示：与对照组比较，模型组大鼠滑膜组织中MVD 升高，滑膜组织中VEGF 表达水平升高，PTEN 蛋白表达水平降低，PI3K、AKT和p-AKT 蛋白表达水平升高；与模型组比较，治疗组和阳性药物组大鼠体质量升高，足爪厚度降低，滑膜组织中MVD 降低，滑膜组织中VEGF 表达水平降低， PTEN 蛋白表达水平升高， PI3K、AKT 和p-AKT 蛋白表达水平降低；与阳性药物组比较，治疗组大鼠滑膜组织中各指标改善更显著。类风湿性关节炎血管新生的分子机制复杂，PI3K/Akt 信 号 通 路 为 经 典 的 信 号 通 路［17］。PI3K 参 与 多种信号通路，与Akt 共同组成的PI3K/Akt 信号通路在类风湿性关节炎的发生中发挥重要作用［18］。PI3K 具有调节细胞增殖、凋亡和新陈代谢的作用，在类风湿性关节炎的滑膜组织中PI3K 表达水平升高，升高的PI3K 促进Akt 磷酸化，激活PI3K/Akt信号通路；活化的Akt 可磷酸化多种蛋白，介导细胞的生长发育和血管生成的调节［19］。 PTEN 为PI3K/Akt 信号通路重要的调控因子，为PI3K/Akt信号通路的负性调节蛋白，可阻止PI3K/Akt 通路激活， 从而抑制细胞生长和血管新生的形成［20］。由此可见，PTEN/PI3K/Akt 信号通路在类风湿性关节炎发病中发挥重要作用。VEGF 为滑膜血管新生的直接诱导因子，VEGF 直接作用于滑膜组织的血管内皮，刺激血管内皮细胞发生分裂和增殖，增加微血管通透性，导致血管形成［21］。VEGF 的表达受PTEN/PI3K/Akt 信号通路的调节， PTEN/PI3K/Akt 信号通路活化可诱导VEGF 转录增加，从而促进滑膜组织血管新生增加［22］。研究［23-24］显示：雷公藤内酯醇可通过PI3K/AKT 信号通路发挥作用。本文作者推测：雷公藤内酯醇通过上调滑膜组织中PTEN 蛋白的表达，从而抑制PI3K/Akt信号通路的活化，减弱PI3K/Akt 信号通路活性，减弱Akt 磷酸化，从而抑制其下游的VEGF 等因子的产生，抑制滑膜组织新生血管生成，发挥对类风湿性关节炎的治疗作用。本文作者发现：类风湿性关节炎大鼠的足爪厚度和关节炎指数与VEGF 及p-AKT 呈正相关关系， 与PTEN 呈负相关关系；MVD 与VEGF、 PI3K 和p-AKT 呈 正 相 关 关 系，与PTEN 呈负相关关系，表明PTEN/PI3K/Akt 可以通过调控VEGF 表达参与类风湿性关节炎的发病过程，雷公藤内酯醇治疗类风湿性关节炎的机制可能与PTEN/PI3K/Akt 通路有关联。本研究中阳性对照药物双氯芬酸钠对PTEN/PI3K/Akt 信号和血管生成也有一定的调控作用， 但其在调控PTEN/PI3K/Akt 信号和血管生成方面，雷公藤内酯醇较阳性对照药物双氯芬酸钠更具优势。至于阳性对照药物双氯芬酸钠对PTEN/PI3K/Akt 信号和血管生成的作用机制尚不清楚，目前也尚无相关方面的研究， 尚需以后通过进一步实验进行研究探讨。

综上所述，雷公藤内酯醇治疗类风湿性关节炎效果显著， 其机制可能与其可调控PTEN/PI3K/Akt 信号通路，从而调节滑膜内血管形成有关联。雷公藤内酯醇治疗类风湿性关节炎的疗效与双氯芬酸钠相当，但在调控滑膜内血管新生方面优于双氯芬酸钠。