骨保护素对大鼠正畸牙齿移动过程中破骨细胞分化和p38-MAPK 信号通路的影响

2020-12-15 07:03颖,
吉林大学学报(医学版) 2020年6期
关键词:牙周组织牙槽骨磨牙

娄 颖, 马 欣

(河南省人民医院口腔正畸科,河南 郑州 450001)

支抗控制为正畸治疗是否成功的关键,传统的支抗或多或少存在不足之处,故越来越多的学者尝试寻找更好的增强支抗的方法,其中金属基质蛋白酶抑制剂和二磷酸盐等均有抑制牙齿移动的作用,二磷酸盐在骨科中应用较为广泛,但其在骨组织中不容易被代谢,故具有一定局限性。研究[1]显示:骨保护素在正畸牙齿移动过程中具有较好的控制牙齿移动的作用,但其作用机制不清楚,尚需要做进一步探讨。破骨细胞生成和活化在控制牙齿移动过程中发挥重要作用,研究[2-3]显示:抑制骨保护素的表达可促进破骨细胞生成和分化,提高骨保护素表达可抑制破骨细胞生成和分化,从而抑制牙齿移动。破骨细胞的生成和分化受多种信号通路的调控, p38- 丝裂原活化蛋白激酶(p38-mitogen activated protein kinase, p38-MAPK) 信号通路为调控破骨细胞分化过程的重要信号通路,抑制该通路可抑制破骨细胞分化和局部骨吸收[4]。骨保护素在抑制正畸牙齿移动过程中是否通过p38-MAPK信号通路发挥作用尚不十分清楚。本文作者研究骨保护素对大鼠正畸牙齿移动过程中破骨细胞分化和p38-MAPK 信号通路的影响,探讨骨保护素在正畸治疗支抗控制中的作用机制。

1 材料与方法

1.1实验动物、主要试剂和仪器128 只3 月龄、健康、清洁级、雄性、SD 大鼠购自北京华阜康生物科技股份有限公司,体质量280~310 g,动物生产许可证号:SCXK (京) 2014-000。注射用重组人骨保护素(上海科肽生物技术有限公司),多聚甲醛、EDTA 脱钙液、伊红和苏木精(武汉博士德生物工程有限公司), TRAP 染色试剂盒(美国Sigma-Aldrich 公司), 兔抗鼠p-p38 单克隆抗体、兔抗鼠核因子κB 受体活化因子(receptor activator of nuclear factor-kappa B, RANK) 单克隆抗体、兔 抗 鼠 基 质 金 属 蛋 白 酶 9 (matrix metalloproteinase-9, MMP-9) 单克隆抗体(美国Sigma 公司)。正畸用0.25 mm 结扎丝(杭州奥索医疗器械有限公司),正畸用镍钛螺旋弹簧(北京圣马特科技有限公司),正畸测力计(长沙天美医疗器械有限公司),Leica 切片机(上海徕卡仪器有限公司)。

1.2动物分组和处理将128 只大鼠根据随机数字法分为对照组和骨保护素组,每组64 只。于开始建模前3 d,骨保护素组大鼠于左上颌第一磨牙鄂 侧 黏 骨 膜 下 注 射 重 组 人 骨 保 护 素( 0.05 mg·kg-1)[5], 对照组大鼠在相同部位注射等量生理盐水。

1.3正畸牙齿移动大鼠模型的建立将2 组大鼠采用戊巴比妥钠腹腔注射麻醉,麻醉成功后将大鼠固定到手术台上,在上颌左侧第一磨牙和第二磨牙的邻接点穿过结扎丝,结扎丝绕第一磨牙牙颈部1 周,将另一根结扎丝在近中处结扎固定,在第一磨牙近中结扎丝处穿入镍钛螺旋弹簧,弹簧另一端穿入结扎丝,力值为50 g。在上颌两中切牙唇、舌和远中面紧贴牙龈缘的牙颈部,用装有金刚砂车针的牙科手机各磨1 个深约0.2 mm 的浅沟。将和弹簧项链的结扎丝切入切压槽沟内,将两切牙环扎为1 个整体,将弹簧的力值一直保持在50 g。清洁上颌两中切牙压面,牙面上涂擦自酸蚀粘结剂,复合树脂填充材料糊塑,以两上颌中切牙为支抗,近中移动左侧第一磨牙。术后密切观察大鼠生命体征,灯光保暖。每周加力1 次,弹簧拉力维持在50 g。共4 周。

1.4 2组大鼠第一磨牙移动距离检测每组取8 只大鼠,分别于加力前和加力后(即加力1、2、3 和4 周时),采用藻酸盐印模材料在大鼠牙齿加力前后取上颌印模,印模灌注形成石膏模型,修整模型基地,使其和后牙的平面平行,测定加力侧(左侧) 第一磨牙近中舌沟点和第三磨牙远中面之间的距离,共3 次,取平均值,加力前后的距离差即为加力侧第一磨牙的移动距离。

1.5标本采集分别于加力1、2、3 和4 周时,每组取8 只大鼠,心脏灌注法处死大鼠,手术剪剪下完整左侧上颌第一磨牙和其近远中牙槽骨,去净周围软组织,将组织块放入甲醛中固定24 h,用于HE 染色和免疫组织化学染色。每组另各取8 只大鼠,水合氯醛麻醉处死大鼠,取大鼠左侧上颌第一磨牙近中腭根的冠方牙槽骨(牙槽峭顶至根尖距离的1/2 高度,宽约2 mm),放入EP 管中,置于冰箱中,用于Western blotting 检测。

1.6标本制作将大鼠上左侧颌第一磨牙区牙周组织用生理盐水冲洗,放入多聚甲醛中固定24 h,加入EDTA 脱钙液脱钙6 周,3 d 换液1 次,大头针刺入无阻力时为脱钙完全。酒精脱水,二甲苯透明, 石蜡包埋,采用切片机沿牙体长轴切成近远中向的厚2 μm 的切片,将切片置于烤箱中烤干。

1.7抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色测定2组大鼠牙周组织中破骨细胞数石蜡切片经烤片、脱蜡、 脱水, 每张切片 滴加TRAP 染 色液100 μL,孵育50 min,蒸馏水冲洗,苏木精溶液复染2 min,碱性自来水冲洗至出现核蓝染,自然晾干,中性树胶封片,显微镜下观察。阳性结果为破骨细胞胞核呈蓝色,胞浆呈深红色或酒红色;具有3 个或3 个以上胞核的为成熟破骨细胞。400 倍光镜下观察染色情况,采用Image-Pro Plus 6.0 图像分析软件计算每个高倍视野内破骨细胞数。

1.8免疫组织化学染色检测2组大鼠压力侧牙周组织中p-p38表达水平石蜡切片经烤片、脱蜡、脱水,蒸馏水冲洗,加入抗原修复液高压修复3 min,蒸馏水冲洗,加入过氧化氢孵育10 min 灭活内源性过氧化物酶,蒸馏水冲洗,加入一抗:加入兔抗鼠p-p38 单克隆抗体(1∶200) 过夜孵育,阴性对照以PBS 代替一抗,加入聚合物辅助剂孵育15 min,加入二抗孵育30 min,DAB 显色,自来水冲洗,常规复染、脱水、透明,中性树胶封片。 采用Image-Pro Plus 6.0 图像分析软件分析大鼠压力侧p-p38 阳性表达情况,并记录p-p38 的积分光密度(IOD) 值,以IOD 值代表p-p38 表达水平。

1.9 Western blotting法检测2组大鼠牙周组织中RANK和MMP-9蛋白表达水平取牙槽骨组织块,液氮下研磨成粉末,加入蛋白裂解液提取牙槽骨总蛋白,采用BCA 法测定牙槽骨蛋白浓度,经常规变性、灌胶、上样、电泳、转膜和脱脂奶粉封闭后,加入一抗: 兔抗鼠RANK 单克隆抗体(1 ∶200) 和兔抗鼠 MMP-9 单 克 隆 抗 体(1 ∶300) 过夜孵育,加入二抗(1∶5 000) 孵育1 h, 滴加显影液显影, 曝光。 以β-actin 为内参。采用Image Lab software 软件检测各蛋白条带灰度值,计算目标蛋白表达水平。目标蛋白表达水平=目标蛋白条带灰度值/β-actin 条带灰度值。

1.10大鼠牙周组织破骨细胞数、RANK和MMP-9蛋白表达水平与p-p38表达水平的相关性分析2 组大鼠牙周组织中破骨细胞数、RANK 和MMP-9 蛋白表达水平与p-p38 表达水平的相关性分析采用Pearson 相关分析法。

1.11统计学分析采用SPSS 20.0 统计软件进行统计学分析。2 组大鼠第一磨牙移动距离、牙周组织中破骨细胞数、p-p38 表达水平、RANK和MMP-9蛋白表达水平符合正态分布,以x±s表示,组间比较采用t检验。以P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 2组大鼠第一磨牙移动距离对照组和骨保护素组大鼠在加力1、2、3 和4 周时牙齿移动距离均逐渐增加(P<0.05)。加力1 周时,2 组大鼠牙齿移动距离比较差异无统计学意义(P>0.05);加力2、3 和4 周时,骨保护素组大鼠牙齿移动距离小于对照组(P<0.05)。见表1。

2.2 2组大鼠牙周组织中破骨细胞数加力前3 周破骨细胞数逐渐增多,加力3 周时破骨细胞最多,加力4 周时破骨细胞数有所降低。组间比较:加力1 周时,2 组破骨细胞数比较差异无统计学意义(P>0.05);加力2、3 和4 周时,骨保护素组大鼠牙周组织中破骨细胞数小于对照组(P<0.05)。见图1 (插页六) 和表2。

表1 2 组大鼠第一磨牙移动距离Tab.1 Movement distance of first molar of rats in two groups (n=8,x±s,l/mm)

表2 2 组大鼠破骨细胞数Tab.2 Number of osteoclasts of rats in two groups(n=8,x±s)

2.3 2组大鼠压力侧牙周组织中p-p38表达水平免疫组织化学染色结果显示:细胞浆呈黄褐色细胞为p-p38 阳性细胞,一般位于骨吸收陷窝内。加力1 周时, 2 组大鼠破骨细胞中有少量p-p38 阳性表达,随着时间的增加,破骨细胞中p-p38 阳性表达增加,加力3 周时p-p38 阳性表达最多,且细胞浆和细胞核均染色,加力4 周时p-p38 表达阳性表达有所减少。组间比较:加力1 周时,2 组大鼠压力侧牙周组织中p-p38 水平比较差异无统计学意义(P>0.05);加力2、3 和4 周时,骨保护素组大鼠压力侧牙周组织中p-p38 表达水平小于对照组(P<0.05)。见图2 (插页六) 和表3。

2.4各组大鼠牙槽骨组织中RANK和MMP-9蛋白表达水平各时间点,骨保护素组大鼠牙槽骨组织中RANK 和MMP-9 蛋白表达水平均低于对照组(P<0.05)。见图3 和表4。

表3 2 组大鼠压力侧牙周组织中p-p38 表达水平Tab.3 Expression levels of p-p38 on pressure side of periodontal tissue of rats in various groups (n=8,x±s)

图3 Western blotting 法检测2 组大鼠牙槽骨组织中RANK 和MMP-9 蛋白表达电泳图Fig.3 Electrophoregram of expressions of RANK and MMP-9 proteins in alveolar bone tissue of rats in two groups detected by Western blotting method

表4 2 组大鼠牙槽骨组织中RANK 和MMP-9 蛋白表达水平Tab.4 Expression levels of RANK and MMP-9 proteins in alveolar bone tissue of rats in two groups (n=8,x±s)

2.5加力3周时大鼠牙周组织中破骨细胞数、RANK和MMP-9蛋白表达水平与p-p38表达水平的相关性分析加力3 周时大鼠牙周组织中破骨细胞数、RANK 和MMP-9 蛋白表达水平与p-p38 表达水平均呈正相关关系(P<0.05)。见表5。

表5 加力3 周时大鼠牙周组织中破骨细胞数、RANK 和MMP-9 蛋白表达水平与p-p38 表达水平的相关性Tab.5 Correlations between osteoclast number, RANK and MMP-9 protein expression levels and expression level of p-p38 in periodontal tissue of rats 3 weeks after stressing

3 讨 论

牙槽骨是不断更新的组织之一,由成骨细胞介导的骨形成和破骨细胞介导的骨吸收的动态平衡维持正常的骨代谢过程[6]。骨吸收要通过破骨细胞的活化完成,成熟的破骨细胞形态为椭圆形或圆形,形态不规则,直径10~100 μm,随着细胞的老化,破骨细胞的胞浆从嗜碱性转化为嗜酸性。破骨细胞的成熟在骨形态维持和骨重建中发挥重要作用[7]。在正畸治疗中,破骨细胞的生成和分化在牙齿移动过程中发挥重要作用,破骨细胞生成过多促进牙齿移动,反之破骨细胞生成过少抑制牙齿移动[8-9]。本研究中,对正畸治疗模型大鼠给予骨保护素治疗,发现骨保护素可抑制压力侧破骨细胞数量,抑制牙齿移动,抑制牙槽骨中RANK 和MMP-9 蛋白表达。 RANK 为破骨细胞的表型标志物, RANK水平升高表明破骨细胞数增加[10]。MMP-9 为破骨细胞活化的标志物,MMP-9 水平升高表明破骨细胞活化,骨吸收活性增加[11]。RANK 和MMP-9 蛋白水平降低表明破骨细胞的生成和活化受到抑制。本研究结果表明:骨保护素具有抑制牙齿移动的作用,其机制可能为骨保护素可抑制破骨细胞生成和分化。正畸治疗过程中支抗牙的控制为重要环节,破骨细胞生成和活化在牙齿移动中发挥重要作用[21];骨保护素具有抑制破骨细胞生成和活化的作用,且骨保护素的代谢产物容易排泄,不会在局部沉积,故骨保护素可用于正畸治疗,抑制牙齿移动,增加支抗作用[13-14]。牙齿移动过程中, 加力7 d 后即开始出现修复,破骨成骨趋向于一个平衡状态,本研究结果显示:破骨吸收活性延后,在加力1 周时压力侧牙槽骨形成破骨细胞,加力2 周时牙槽骨局部出现潜掘性吸收,邻近牙槽骨出现大量破骨陷窝;加力3 周时破骨陷窝进一步增加,潜掘性吸收继续,出现广泛骨吸收。

MAPK 信号通路在破骨细胞的生成及活化中发挥重要作用,p38-MAPK 为MAPK 信号通路中的一条重要的信号通路[15-16],破骨细胞及其前体的RANK 可 激 活p-p38, p38 具 有 活 性, 激 活 的p38-MAPK 通路参与破骨细胞的形成过程[17-18]。骨保护素可通过多种信号通路发挥作用,ZHAO 等[19]发 现: 骨 保 护 素 通 过 钙、 ERK 和p38-MAPK 信号通路诱导破骨细胞中的足小体分解,由此推测骨保护素可能通过p38-MAPK 信号通路参与正畸治疗的牙齿移动过程。本研究结果显示:骨保护素治疗可抑制牙槽骨组织中p-p38 表达水平升高,表明骨保护素在正畸治疗过程中可抑制p38-MAPK 信号通路激活。本研究结果显示: 牙周组织中破骨细胞数、RANK 和MMP-9 蛋白表达水平与p-p38 表达水平均呈正相关关系,表明骨保护素抑制正畸治疗大鼠第一磨牙移动的作用机制可能为骨保护素抑制牙槽骨组织中p38-MAPK 信号通路激活,p38-MAPK 信号通路失活可抑制破骨细胞的生成和分化,从而抑制正畸牙齿移动,发挥增加正畸支抗作用。

综述所述,骨保护素在正畸治疗中可发挥支抗作用,其机制可能为骨保护素抑制p38-MAPK 信号通路激活,进一步抑制破骨细胞生成和分化,从而发挥抑制牙齿移动的作用。

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