骨肉瘤组织中赖氨酸羟化酶2 表达情况及与病情程度的相关性分析

念其钱

福州市第二医院病理科，福建福州 350007

骨肉瘤又称之为成骨肉瘤， 是从间质细胞系发展而来，发生后可出现疼痛、发热、肿块、跛行等症状，该病多发于儿童和青少年，恶性程度较高，对患者健康乃至生命安全造成严重威胁[1]。 目前临床通过手术、放化疗使骨肉瘤患者生存时间显著增加， 但部分患者初诊时就已经发生肺转移，该类患者往往预后不良[2]。 准确评估骨肉瘤患者病情程度，为临床治疗提供可靠依据，是改善患者预后的关键。 近年来研究发现赖氨酸羟化酶2 在胶原纤维沉积和重构上有重要作用， 而骨肉瘤的发生与发展与胶原纤维的重构和沉积密切相关，故认为赖氨酸羟化酶2 与骨肉瘤侵袭、转移有关，不过其在骨肉瘤组织中的表达情况及与病情程度的关系的相关报道尚少[3]。 该研究方便选择2017 年8 月—2019 年11 月的47 例骨肉瘤患者就此展开分析，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

方便选择该院47 例骨肉瘤患者进行研究，该次研究经医院伦理委员会批准。 47 例患者包括男性27 例，女性20 例，年龄10~41 岁，平均年龄（21.57±6.43）岁；肿瘤位于胫骨或股骨38 例，其他部位9 例;Enneking 分期为Ⅰ期6 例，ⅡA 期13 例，ⅡB 期16 例，Ⅲ期12 例；软组织浸润29 例，无软组织浸润18 例；骨肉瘤细胞淋巴结转移14 例，未转移33 例。 所有患者均取新鲜骨肉瘤肿瘤组织及癌旁正常组织为标本， 采集标本后快速放置于液氮中，并于-80℃环境下保存备用。 纳入标准：①经手术病理确诊为骨肉瘤；②术前未接受任何治疗；③签署知情同意书；④资料完整。 排除标准：①存在癌症家族史；②合并其他系统性慢性疾病；③合并其他肿瘤性疾病；④合并其他影响检测指标的疾病。

1.2 方法

采用Westem bolt 法对PLOD2 的表达进行检测，以sh-PLOD2、sh-NC、LV-over/PLOD2、LV-vector 转染U-2O S 细胞，常规进行24 h 培养，取蛋白裂解液加入，冰上裂解1 h。 在4℃环境下以12 000 r/min 的速度进行15 min 的离心处理，取上清液，采用蛋白质定量（BCA）分析试剂盒测定蛋白浓度后， 放置于-80℃环境下储存备用。取30 μg 蛋白质在十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，以半干法转移到聚偏二氟乙烯膜上，5%脱脂奶粉室温封闭2 h， 加入一抗4℃过夜， 以缓冲液（TBST）进行3 次洗膜。 加入二抗，于室温下进行2 h 孵育，再次以TBST 进行3 次洗膜处理。 取化学发光显色试剂加入，在暗室中拍摄X 线片显影，进行图像扫描，以β-actin 为内参照，使用凝胶图像分析软件对目标条带的灰度值进行分析。重复进行3 次实验。PLOD2 蛋白定位于细胞质呈棕褐色为阳性， 根据染色强度与阳性细胞百分比计算免疫组化染色得分， 得分1~4 分为低表达，＞4 分为高表达。 免疫组化染色及评分方法：石蜡切片常规烤片，并进行逐级脱蜡、脱水处理，经3%H2O2孵育以将内源性过氧化物酶活性消除， 然后置于10%山羊血清封闭， 加入一抗后于室温进行1 h 的孵育，经PBS 冲洗后加入二抗，再于室温进行15 min 的孵育，二氨基联苯胺显色后苏木素复染，梯度乙醇脱水，在二甲苯透明之后封片，以PBS 替代一抗作为阴性对照。

1.3 观察指标

观察比较PLOD2 在骨肉瘤组织、 癌旁正常组织中的阳性表达情况， 同时比较不同Enneking 分期患者PLOD2 表达及骨肉瘤细胞有无淋巴结转移患者、 软组织有无浸润患者PLOD2 表达情况，分析PLOD2 与骨肉瘤分期及是否转移、软组织浸润的相关性。

1.4 统计方法

采用SPSS 19.0 统计学软件进行数据分析，计数资料以频数及百分比表示，组间差异比较以χ2检验，相关性分析采用Pearson 检验。 P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 PLOD2 阳性表达情况

PLOD2 在骨肉瘤组织中的阳性表达率为72.34%，在癌旁正常组织中的阳性表达率为6.38%，差异有统计学意义（P＜0.05）；不同Enneking 分期患者PLOD2 表达显示，Ⅰ~ⅡA 期的阳性表达率为52.63%，与ⅡB~Ⅲ期85.71%比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；骨肉瘤细胞转移患者PLOD2 表达阳性率为92.86%，软组织浸润患者阳性表达率为75.86%，与未转移、未发生软组织浸润比较，差异有统计学意义（P＜0.05），见表1。

表1 PLOD2 阳性表达情况对比[n(%)]

2.2 Pearson 相关性分析

经Pearson 相关性分析显示，PLOD2 与骨肉瘤ⅡB~Ⅲ期及淋巴结转移、软组织浸润呈正相关性（r=0.698、0.663、0.711， P＜0.05）。

3 讨论

骨肉瘤是多发于20 岁以下青少年或儿童的一种常见恶性肿瘤， 目前针对该病的治疗尚无特效治疗手段， 虽然诸多研究显示辅助化疗能够促进患者预后改善，但疾病复发患者预后仍较差，因此探索新的治疗方式促使骨肉瘤患者生存率有效提高意义重大[4]。 研究认为骨肉瘤的发病机制可能与生长因子、抑癌基因、染色体等因素有关，但对于骨肉瘤侵袭、转移分子机制尚不明确， 临床在使用抑制骨肉瘤细胞侵袭、 迁移的药物时，缺乏判断骨肉瘤病情程度变化的敏感生物标志物，因此针对该方面的研究是当前重点课题[5-6]。

PLOD2 是一种介导胶原赖氨酸羟化的酶， 相较于非羟化赖氨酸残基， 羟化赖氨酸残基能够产生更强的胶原交联稳定性，PLOD2 能够通过胶原修饰及细胞外基质重塑介导低氧诱导的肿瘤转移，其在肿瘤细胞、间质成纤维细胞中上调表达可改变胶原交联肿瘤基质，促使胶原纤维形成，进而造成肿瘤细胞侵袭、迁徙[7-8]。有研究发现，PLOD2 高表达能够促进胶原纤维交联，使肿瘤病灶处的胶原纤维的沉积增加， 进而诱发癌细胞淋巴结转移， 不过关于PLOD2 在骨肉瘤中表达情况的研究报道尚少[9-10]。 该研究结果显示，PLOD2 在骨肉瘤组织中的阳性表达率明显高于在癌旁正常组织中的阳性表达率，说明在骨肉瘤肿瘤组织中PLOD2 呈高表达，其在骨肉瘤诊断中具有重要作用。 PLOD2 是一种胶原蛋白修饰酶，而胶原蛋白类似于层粘蛋白、弹性蛋白、纤维连接蛋白等，是一种细胞外基质蛋白，能够对组织内稳态、 炎症、 器官发育及癌症等进行调节， 因此PLOD2 异常表达可对细胞外基质造成破坏， 促进细胞侵袭、迁移[10]。而且PLOD2 下游信号通路中的己糖激酶2、整合素A3 也可能对其表达产生影响，从而导致细胞内信号，引起肿瘤侵袭、转移情况[11]。 樊李瀛等[12]研究中也认为骨肉瘤肿瘤组织中PLOD2 基因表达水平较癌旁正常组织明显更高，这与该研究结果一致。 而且该研究结果显示肿瘤分期与PLOD2 表达呈正相关，骨肉瘤细胞转移、 软组织浸润患者的PLOD2 表达阳性率分别为79.03%、75.76%，明显高于未转移、未浸润者，该研究结果中骨肉瘤Enneking 分期为Ⅰ~ⅡA 期的PLOD2 阳性表达率明显低于ⅡB~Ⅲ期，骨肉瘤细胞转移、软组织浸润患者的PLOD2 表达阳性率分别为92.86%、75.86%，明显高于骨肉瘤细胞未转移、软组织未浸润的患者，与上述研究结果大致相同，说明PLOD2 的表达随着骨肉瘤患者病情程度的加重而增高。 该研究进行Pearson 相关性分析显示，PLOD2 与骨肉瘤ⅡB~Ⅲ期及淋巴结转移、软组织浸润呈正相关性，充分印证了上述研究结论。

综上所述，PLOD2 在骨肉瘤组织中呈高表达，其阳性表达与骨肉瘤分期及转移、软组织浸润呈正相关性，可作为临床判断病情进展及预后的指标。