天然化合物防治茄科青枯劳尔氏菌研究进展

王琳琳，张恒恺，陈欣鑫，陈立，李建科

（陕西师范大学食品工程与营养科学学院，陕西西安 710119）

青枯病（bacterial wilt）是由茄科青枯劳尔氏菌（）俗称青枯菌引起的茄科植物萎调病，在我国长江流域及南方地区普遍发生，严重影响经济作物的产量和质量。青枯菌寄主范围广泛，地理分布广泛，青枯菌能够在没有寄主的情况下长期存活于土壤中[1]。青枯病一旦暴发就难以控制，造成作物的大面积萎蔫死亡甚至绝收[2]。是作为全世界危害最大的土传病害之一。现有的防控措施如化学防治、嫁接轮作、土壤改良和抗病品种培育等效果均不理想，并且存在污染环境和引起病菌抗性等诸多隐患。因此发展环境友好型的防治措施、开发新型天然抗菌化合物，成为青枯菌防治研究的热点。

天然抗菌化合物因具有无毒、无污染和生物相容性好等特点被广泛关注。有研究发现天然化合物主要通过两种途径抑制病原菌增殖：一是破坏病原菌细胞壁、细胞膜结构，改变菌体形态，影响细胞渗透性；二是干扰病原菌致病相关蛋白表达和信号传导[3-4]。本文就不同来源天然化合物的抑菌现状，探究其对青枯菌的抑制机理，为青枯病的防治探寻环保新方法。

1 青枯病的防治方法

青枯菌通常从植物次生根部或茎部的伤口侵入，在根皮层细胞间隙定植，侵染皮层组织，然后感染侵入木质部导管薄壁组织，分泌大量胞外多糖（extracellular polysaccharide，EPS），阻塞导管内水分运输，从而引起植物萎蔫死亡[5]。青枯菌致病机理的研究滞后，导致了青枯病防治上的困难。

目前青枯病的防治以预防为主，结合土地轮种和抗性品种培育等方式控制病害。但是这种传统的方法有一定的局限性，轮种不能彻底抑菌，而抗性品种由于病原菌变化快也容易丧失抗性。化学防治是目前防治青枯病的主要方法，但存在农残和污染环境等潜在危害。噬菌体和生防菌等生物防治方法具有效果好、无药害等优点，但是噬菌体防治青枯病易受到寄主范围的限制，这也是噬菌体未能广泛地推广的原因。生防菌是近年来生物防治的研究热点，但是因土壤环境复杂多样，利用生防菌防控病害的效果并不稳定。在这一背景下，环境友好型天然抗菌化合物的研发受到青睐。

2 抑制青枯菌的天然化合物及其研究现状

2.1 植物来源的抑菌化合物

植物含有种类丰富的天然抗菌化合物，这些抗菌化合物易于降解、对环境友好、来源丰富。目前研究的植物天然抗菌化合物主要是植物各级组织的提取物或是其次生代谢产物，按化学结构可划分为酚类、生物碱类、黄酮类、醇类、苷类、醛类、醌类、有机酸类等[6]。

2.1.1 酚类

目前有很多酚类物质能有效抑制青枯菌。张恒恺等[7]研究发现茶多酚可显著抑制青枯菌增殖及其细菌泳动能力（swimming mobility）。扫描电子显微镜观察发现当茶多酚作用于青枯菌细胞时，细胞壁遭到明显破坏，推测细胞膜的通透性增加导致了金属离子和蛋白质外渗，进而使细胞代谢发生紊乱，逐渐破坏细胞结构。Wanming Bai 等[8]研究发现紫丁香花蕾中的主要抗菌成分丁香酚可以显著抑制青枯菌，导致鞭毛消失，内容物泄漏和出现空腔。SDS-PAGE 显示丁香酚降低了青枯菌中的蛋白质含量，降低了中型碳水化合物的利用，并抑制了过氧化氢酶和琥珀酸脱氢酶的活性。

2.1.2 精油类

植物精油是广泛存在于植物中的次级代谢产物，具有抑菌广谱、通用性好等优点。Paret 等[9]比较了三种精油化合物（玫瑰草精油、桉树精油、香茅精油）对青枯菌细胞结构的影响，发现三者都能破坏青枯菌细胞结构，引起胞内物质氨基酸、核酸、脂类、碳水化合物等活性成分流失。黄雯等[10]比较了薄荷精油、草果精油、薰衣草精油、山苍子油对青枯菌的抑制作用，发现这四种精油对于青枯菌都具有抑制活性，并发现山苍子油抑菌主要成分为烯烃类化合物，抑菌机理需要进一步探究。

2.1.3 醛醇类

醛类、醇类化合物具有抑菌作用，通常把高浓度醛醇作为抑菌剂。于艳梅等[11]比较了四种植物源化合物香豆素、原儿茶醛、香荆介酚和白藜芦醇对青枯菌的抑制作用，发现这四种天然化合物不同程度地影响了青枯菌的细胞结构、泳动能力和生物膜形成能力。郭兵等[12]通过探究玉米中重要的次生代谢产物2,4-二羟基-7-甲氧基-2H-1,4-苯并嗪-3(4H)酮（丁布，DIMBOA）对青枯菌的抑制活性，发现DIMBOA 及其衍生物能抑制青枯雷尔氏菌生物膜的形成和泳动性，且抑制作用具有显著的浓度效应，同时-Cl 和-SH 取代基能够提高抑菌活性。

2.1.4 其它类物质

除了酚类、精油类、醛醇类等，还有很多天然化合物具有抑制青枯菌的效果。如Fan 等[13]发现甲基没食子酸对青枯菌有较强的抑制作用，扫描电子显微镜观察发现，甲基没食子酸能够损伤青枯菌细胞壁。进一步研究发现其能干扰青枯菌蛋白质合成，抑制琥珀酸脱氢酶和胞外酶的活性，从而抑制青枯菌增殖。李丽萍等[14]通过透射电镜观察发现，紫茎泽兰提取物可影响青枯菌鞭毛形态。王翠颖等[15]发现木麻黄的单宁提取物能够显著影响青枯菌生物膜的合成。此外，有研究者还从多种植物中提取活性成分，发现其提取物如厚朴皮和叶的提取物、大蒜提取物、苋菜提取物、长叶苦竹提取物、苦参生物碱等都对青枯菌显示出了一定的抑菌活性[16-17]。

总之，目前多数植物源化合物对青枯菌的抑制机理都不明确，研究水平多限于细胞结构损伤、细胞内质外流等层面。西南大学Yang 等[18]从基因水平解析了天然植物源化合物抑制青枯菌的机理，研究发现具有苯环和-吡咯烷环的植物源化合物能够影响青枯菌III 型分泌系统（Type III secretion system，T3SS）的表达。伞形酮（umbelliferone）为一种7-羟基香豆素，能够通过和途径抑制T3SS 调控基因表达，降低6 个T3SS 效应子的基因表达水平。

2.2 动物来源的抑菌化合物

近年来，来源于动物及其附属物的天然抗菌物质越来越多，这些成分来自于动物外壳、内脏等，它们来源广泛、易于降解、抗菌活性好。这些天然抗菌物质能够损伤细胞并有效抑制青枯菌增殖，但抑制机理需要进一步探寻。目前研究发现壳聚糖等组分对青枯菌有较好的抑制作用，这使它成为研究的热点，未来有望开发成新型抑菌剂。昆虫体内包含能抑制青枯菌活性的物质，比如蜂胶、天蚕抗菌肽等。这些物质具有天然无公害、抑菌广泛等优点，主要通过破坏菌体形态、抑制游动性等来抑制青枯菌的活性。目前还有许多昆虫来源的天然化合物具有抑菌作用，但是机理不明。

2.2.1 壳聚糖

壳聚糖（chitosan）又称脱乙酰甲壳素，是由自然界广泛存在的几丁质（chitin）经过脱乙酰作用后得到的，是蟹、虾等昆壳类动物外壳的重要成分，在自然界中资源丰富。壳聚糖安全无毒，易于生物降解，且具有较好的抗菌活性，能够抑制真菌、细菌和病毒增殖[19-20]。苏婷等[21]研究发现壳聚糖能较好地抑制青枯菌增殖。扫描电子显微镜观察发现，经壳聚糖处理后的青枯菌细胞膜出现破损，细胞质膜与细胞外膜分离，且细胞内部形成空泡，影响细胞通透性，渗透压失衡。同时，青枯菌的生物膜形成量也受壳聚糖的影响，但壳聚糖对青枯菌的抑制机理仍不清楚。

2.2.2 核黄素

核黄素（Riboflavin）又称为维生素B2，主要功能是作为辅酶促进代谢，广泛存在于各类食品中。它是许多动物生长的必需因素，所以在肝脏、蛋、奶等动物性食品中的含量很高。核黄素可以激活烟草细胞中次生代谢产物的积累增加，从而抑制青枯菌。Liu Fei 等[22]发现核黄素可以在烟草细胞中引起防御反应，促进烟草细胞中总酚类化合物、香豆素和木质素的积累。当将其用于受寄生性疟原虫和茄形青枯菌侵染的烟草植物时，核黄素处理分别产生47.9%和48.0%的保护作用。这些结果表明核黄素可以在细胞悬浮液中诱导一系列防御反应和次级代谢，并保护烟草免受寄生性疟原虫和青枯菌的侵害。

2.2.3 蜂胶

蜂胶是蜜蜂科昆虫采集的植物树脂与其上颚腺、蜡腺等分泌物混合形成的具有黏性的固体胶状物，是一种传统的天然药物，具有广泛的药理学活性，如抗菌、抗病毒、抗病原虫等。许晏等[23]研究发现蜂胶渣的乙醇提取物对青枯菌具有良好的抑制活性，蜂胶渣35%乙醇提取物能够破坏青枯菌形态，导致细胞膜粗糙甚至破裂，部分细胞生长畸形。并且，蜂胶渣提取物的浓度与其对青枯劳尔氏菌泳动的抑制作用呈近似的正相关。Esin Basim 等[24]研究了土耳其花粉和蜂胶提取物对13 种不同农业细菌病原体的“体外”抗菌活性，发现番茄青枯雷尔氏菌在细菌的敏感性中排第三位，对测试细菌的最低活性浓度是花粉提取物的1/100 和蜂胶提取物的1/1 000。

2.2.4 抗菌肽

抗菌肽是生物体产生的一种具有抗菌活性的多肽，广泛存在于自然界中。江仕龙等[25]以天蚕抗菌肽（Cecropin）为基础，修饰合成新型多肽色氨酸-赖氨酸-亮氨酸-苯丙氨酸-赖氨酸-赖氨酸-异亮氨酸-亮氨酸-赖氨酸-酪氨酸-亮氨酸（WKLFKKILKYL）对青枯菌有较好的抑制效果，其抑菌圈显著增大。该新型抗菌肽的疏水性基团占54%，推测其可能直接作用于细菌的细胞膜，通过破坏细菌细胞膜的完整性、造成细胞内容物泄漏，导致细胞死亡。利用基因工程技术和微生物发酵技术繁殖，具有抗菌活性的新型抗菌肽，用于农业生产中防治青枯病，是一种全新的生物防治技术。李乃坚等[26]采用花粉管通道技术，将天蚕抗菌肽B 基因质粒导入到不同烟草子房中，经过基因转化和青枯菌的抗病性鉴定获取抗病植株，并多代接种青枯菌鉴定，然后对植株进行胭脂碱检测、点印迹杂交、PCR 扩增和Southern 印迹杂交检测。结果表明，天蚕抗菌肽月基因已导入烟草基因组，并获得了抗性后代。田间发病率和病情指数分析显示T3 代转基因株系耐病能力增强，病情也明显减轻。T4 代各株系均来自T3 代株系中抗病力最强的单株，抗青枯病能力更强。

3 小结

青枯病防治较困难，目前关于青枯菌的防治仍以化学农药为主，但效果不理想且对环境造成污染。从自然界获取天然化合物来防治青枯菌具有广阔的前景，但天然化合物的提取加工工艺复杂，并且抑菌机理不明确。随着人们对绿色农业的认可，开发利用环境友好型天然化合物防治青枯菌成为大势所趋。寻找、开发天然抑菌物质，制备生物农药，对于防治青枯菌获取经济效益具有重要的意义，环境友好型抑菌剂未来将有广泛的应用。