甜瓜潜在病原菌番茄匍柄霉菌株的分离与鉴定

郝芳敏 臧全宇 马二磊 丁伟红 黄芸萍 王毓洪

摘要    本研究对甜瓜根部病原菌进行分离纯化，并进行ITS序列扩增及测序、系统进化树构建、致病力测定。结果表明，供试菌株为番茄匍柄霉，其可对甜瓜叶片造成17.2 mm的病斑;番茄匍柄霉（Stemphylium lycopersici）有可能是甜瓜潜在的病原菌。

关键词    甜瓜;病原菌;番茄匍柄霉;分离纯化;致病力测定

中图分类号    S652        文獻标识码    A

文章编号   1007-5739（2020）20-0089-02                                                开放科学（资源服务）标识码（OSID）

Abstract    In this paper， the pathogens from the roots of Cucumis melo L. were isolated and purified. ITS sequence amplification and detection， phylogenetic tree construction， and pathogenicity determination were carried out. The results showed that the tested strain was identified as Stemphylium lycopersici， which could cause 17.2 mm lesions on leaves of Cucumis melo L.; Stemphylium lycopersici might be a potential pathogen of Cucumis melo L.

Keywords    Cucumis melo L.; pathogen ; Stemphylium lycopersici; isolation and purification; pathogenicity determination

甜瓜（Cucumis melo L.）为一年生蔓生植物，是重要的经济作物，果实含有人体所需的碳水化合物和各种微量元素等营养物质，口感清香，被列为世界十大水果之一[1]。但是在甜瓜的栽培、果实成熟、运输等过程中，会遭受到多种病原菌的侵染，例如镰刀菌（Fu-sarium spp.）[2-6]、链格孢菌（Alternaria alternata）[7]、曲霉菌（Aspergillus niger）[8]、黑点根腐病菌（Monosporascus cannonballus）[9]、蔓枯病菌（Didymalla bryoniae）[10]、白粉病菌（Golorinomyces cichoracearum）[11]、甜瓜炭疽病菌（Colletorichum orbiculare）[12]、细菌性果斑病菌（Acidov-orax avenae）[13]、细菌性角斑病菌（Pseudomonas syring-ae）[14]等多种病原菌。此外，在甜瓜栽培过程中，可能同时有多种病原菌侵染造成病害，例如黑点根腐病菌和镰刀菌同时侵染根部等现象。

匍柄霉属（Stemphylium Wallroth）是一类世界范围内常见的丝状真菌，可造成番茄、大蒜、西葫芦、甘蓝、大葱等多种蔬菜和其他植物的病害[15-17]。2002年报道，山东省3万个番茄大棚暴发的匍柄霉叶斑病，发病率高达90%，造成番茄生产受损严重、品质下降[18]。

本研究针对发病甜瓜的根部进行真菌分离，获得了镰刀菌（Fusarium spp.）、黑点根腐病菌（M. cannon-ballus）以及番茄匍柄霉（Stemphylium lycopersici），并对番茄匍柄霉进行致病力测定，发现其可以对甜瓜叶片造成17.2 mm的病斑，尽管现在尚未在甜瓜叶片上发现这种病原菌，但是认为番茄匍柄霉是甜瓜潜在的病原菌。

1    材料与方法

1.1    试验材料

1.1.1    马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基。马铃薯200 g、葡萄糖20 g、琼脂20 g、蒸馏水1 000 mL，121 ℃灭菌20 min。

1.1.2    CTAB。CTAB 20 g、NaCl 81.82 g、1 mol/L Tris-HCl（pH值8.0）100 mL、0.5 mol/L EDTA（pH值8.0）40 mL，加蒸馏水定容至1 L，121 ℃ 灭菌20 min。

1.2    试验方法

1.2.1    采样和病原菌分离。2019年在浙江省宁波市东钱湖镇甜瓜种植区采集甜瓜病根，对病根进行病原菌分离。将甜瓜病根切成小块，在1%次氯酸钠溶液中浸泡3 min，取出在75%乙醇中浸泡1 min，再用无菌水冲洗3遍，吸干水分后，转移到含链霉素PDA培养基（培养基氯霉素浓度为100 μg/L）上，在25 ℃条件下培养，直至长出真菌菌落，再进行单孢分离，将分离的真菌进行纯化、保存。

1.2.2    DNA序列扩增及种特异性检测。采用CTAB裂解法对供试菌株进行DNA的提取。以供试菌株的DNA为模板，对内部转录间隔区（internal transcribed spacer，ITS）进行PCR反应，采用50 μL PCR反应体系进行扩增，扩增ITS的引物为ITS1/ITS4（ITS1序列：5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′，ITS4序列：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′），PCR产物采用1%琼脂糖凝胶电泳法检测，对阳性PCR产物进行纯化，再进行克隆和测序[19]。

1.2.3    系统进化树的构建。将测序获得的ITS序列通过在NCBI网站（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）上进行核酸序列比对，对菌株的ITS序列利用MEGA 7[20]软件构建系统进化树，以获得该菌株的分类地位。

1.2.4    生长速度和致病力测定。①生长速度测定。将供试菌株接于PDA平板上，置于25 ℃条件下培养3 d。用灭菌的打孔器（直径6 mm）在供试菌株菌落边缘打取新鲜的菌丝块，然后将菌块转接到PDA平板上，置于25 ℃恒溫箱中培养。3次重复。每隔24 h测1次菌落直径，菌丝生长速度（mm/d）=（48 h菌落直径-24 h菌落直径）/2。②致病力测定。采用接种离体甜瓜叶片法对供试菌株进行致病力测定。将供试菌株接种于PDA平板上，置于25 ℃条件下培养3 d，用灭菌的打孔器（直径6 mm）在供试菌株菌落边缘打取菌丝块，并将菌丝块接种到离体甜瓜叶片上，以无菌丝块的PDA为对照，然后放置于铺有湿润吸水纸的托盘中，每个处理3片叶，每个叶片接种2个菌丝块。用保鲜膜覆盖接种盘，置于25 ℃下培养，5 d后测量叶片接种块周围的病斑直径。

2    结果与分析

2.1    供试菌株的菌落形态及致病力测定

在25 ℃下，将供试菌株置于PDA平板上培养，供试菌株的生长速度为6.25 mm/d，9 d可基本覆盖整个培养皿，菌落呈白色，如图1（a）所示。在25 ℃条件下，接种离体甜瓜叶片，5 d后，供试菌株在甜瓜叶片上形成病斑，平均直径为17.2 mm，而无菌丝块的PDA在甜瓜叶片上无病斑，如图1（b）所示。

2.2    供试菌株基于ITS系统进化树的分析

将供试菌株的ITS序列在NCBI上比对发现，与番茄匍柄霉的同源性最高，基于供试菌株的ITS序列，与其他菌株的ITS序列构建系统进化树，可以看到供试菌株聚在Stemphylium lycopersici这一簇（图2），认为是番茄匍柄霉，命名为SL-1。

3    结论与讨论

我国的甜瓜种植面积和产量均居世界第一，具有非常大的市场潜力，但是甜瓜病害一直影响着甜瓜的品质和产量。例如，保护地多年连作导致甜瓜枯萎病、霜霉病、白粉病、蔓枯病等多种病害，以及一些未发现的病害及未明确的病原菌等，都对甜瓜生产产生了影响。本研究在发病甜瓜根部分离获得了一株番茄匍柄霉，其在甜瓜叶片上可以造成病斑，因而猜测番茄匍柄霉有可能是甜瓜潜在的病原菌，但目前还没有过类似的报道。在甜瓜发病的根部，除了分离到的番茄匍柄霉，还有镰刀菌和黑点根腐病菌，猜测该病害可能是由多种病原菌造成的病害，因而对甜瓜病害的预防非常重要。

4    参考文献

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