Riok3条件基因打靶小鼠模型的构建

李 艳，王思怡，章 微，陈露易，李斐雪

(1. 杭州师范大学生命与环境科学学院，浙江 杭州311121； 2. 杭州师范大学理学院，浙江 杭州 311121)

0 引言

卵巢作为雌性哺乳动物重要的生殖器官，呈卵圆形，位于子宫两侧，可以释放成熟的卵母细胞(oocytes)，还可以合成并分泌类固醇激素如雌激素、孕激素等.卵巢发育异常会引起多囊卵巢综合征(polycystic ovarian syndrome，PCOS)及卵巢早衰(premature ovarian failure，POF)等多种疾病，导致不孕不育[1].目前，建立理想的卵巢异常动物模型成为预防和治疗卵巢疾病的关键所在，也是深入理解和研究卵巢异常发病机制、发展和治疗的基础.

图1 卵泡发育示意图Fig.1 Schematic illustration of follicular development

小鼠的卵巢和睾丸都从成对的生殖脊(genital ridge)发育而来[2].小鼠卵巢内存在不同发育阶段的卵泡(follicular)和黄体(corpus luteum).卵泡是卵巢的基本功能单位，从静止的原始卵泡(primordial follicle)状态被激活，经过初级卵泡(primary follicle)、次级卵泡(secondary follicle)、有腔卵泡(antral follicle)等阶段发育至成熟卵泡(mature follicle)[3]，其发育过程见图1.原始卵泡由一个直径小于20 μm的卵母细胞和其周围单层扁平的前体颗粒细胞以及外周鞘细胞组成.在小鼠出生后第3天(P3)出现由立方形颗粒细胞包围的初级卵泡.随着颗粒细胞不断增殖，卵泡膜细胞形成，成为次级卵泡.卵泡刺激素(follicle-stimulating hormone，FSH)调节从次级卵泡到排卵期前卵泡颗粒细胞的增殖与发育[4].次级卵泡的颗粒细胞分离，其间充满卵泡细胞分泌的卵泡液，形成直径达70 μm的卵泡腔.出生后第7天(P7)的小鼠卵巢中可见个别有腔卵泡，第21天(P21)时有腔卵泡明显增多.随之卵泡液增多，卵泡腔变大，形成成熟卵泡[5].成熟卵泡扩展至整个皮质部而突出卵巢表面.

黄体生成素(luteinizing hormone，LH)激活卵泡颗粒细胞中的多个信号通路，使其黄体化，卵丘扩展，卵泡壁裂解，卵细胞被释放，该过程即为排卵[6].排卵后，颗粒细胞转化为具有分泌功能的粒黄体细胞，与卵泡膜血管、成纤维细胞及巨噬细胞一起填满卵泡腔；卵泡膜细胞分化为周边的膜黄体细胞，共同形成黄体[7].黄体的主要功能是产生发情周期与维持妊娠所需的孕酮(progesterone).若卵细胞未经受精或着床失败，黄体将经历结构和功能的退化，逐渐萎缩变成白体(corpus albicans)，从而失去分泌功能[5].

体内信号转导过程中的重要调节蛋白——蛋白激酶，在体内转录、分化、凋亡、代谢、细胞周期、细胞运动和骨架重排中扮演着重要的角色.人体内已知的蛋白激酶有518种，它们负责催化磷酸基团向苏氨酸、酪氨酸和丝氨酸转移[8].激酶可以分为常规激酶和非常规激酶两大类.大部分激酶属于常规激酶，具备典型的激酶结构，由二级结构上保守的序列组成其催化区域.非常规激酶种类较少，在人类基因组中已知的只有40余种.两类激酶在结构上有的相似有的则差别较大，在序列上不相似，但都有激酶的特征性结构.

非常规激酶RIO(right open reading frame)家族蛋白都有相对保守的RIO结构域[8-10]，其中家族成员Riok1和Riok2最早都在酵母中发现[9,11].现已发现从古细菌到哺乳动物中都存在Riok1和Riok2，而Riok3则在较高等的真核生物中存在[12].

在酵母细胞中，Riok1或Riok2任一蛋白激酶的缺失都会导致20S rRNA前体加工受限[11,13].在人体细胞中，Riok3的缺失会使产生18S rRNA过程中21S rRNA前体水平升高[14].然而，在许多真核生物有机体中rRNA前体的加工过程是40S 核糖体亚基成熟的关键环节[15].因此，RIO蛋白激酶在哺乳动物细胞核糖体生物合成中扮演着关键角色.

许多核糖体生物合成相关蛋白在细胞周期过程中发挥着重要的作用[16].RIO激酶家族也不例外.Riok1基因敲除能抑制S期细胞周期进程及酵母细胞的有丝分裂[9,16-17].Riok2是PLK1(polo-like kinase1)的新型靶分子，PLK1介导的Riok2磷酸化能调节HeLa细胞从中期向后期的转换[18].这些研究暗示RIO激酶家族控制细胞周期过程，对细胞的生长有潜在作用.

近期本课题组发现Riok3在小鼠卵巢卵母细胞中表达较高.卵母细胞在卵泡的发育成熟中意义重大，影响卵巢的发育.鉴于RIO激酶家族在细胞周期过程中发挥重要作用，若使卵母细胞中Riok3缺失或失活，是否会影响卵泡的发育导致卵巢早衰？由此，本研究构建了Riok3条件基因打靶的小鼠模型，为进一步研究Riok3在卵巢发育中的功能及其分子机理奠定基础.

1 材料和方法

1.1 实验材料

实验动物：本研究中小鼠的饲养和使用参照《杭州师范大学实验动物管理办法》，受杭州师范大学动物管理委员会的监督.所用材料为SPF(specific pathogen free)级别小鼠，购自杭州师范大学实验动物中心.实验用受精卵由健康7周龄C57BL/6J雌鼠30只与雄鼠10只交配而得；假孕母鼠由健康7周龄ICR(Institute of Cancer Research)雌鼠20只与结扎雄鼠7只交配检阴栓后而得.

实验材料：胎牛血清(Gibco，10099-141)，非必需氨基酸 (Gibco，11140-050)，丙酮酸钠 (Gibco，11360-070)，谷氨酰胺(Gibco，35050-061)，青霉素-链霉素(Gibco，15140-122)，0.05%胰酶-EDTA(Gibco，25300-054)，DMEM(Gibco，11960-069)，DPBS(Gibco，14190-250)，ESGRO mLIf(Millipore，ESG1107)，M16(Sigma，M7292)，干细胞129细胞系W4,来源于杭州师范大学张遵义教授实验室.

1.2 实验方法

1.2.1 原位杂交

收集野生型C57BL/6J雌性小鼠P1、P3、P5的卵巢，通过4%多聚甲醛(PFA)固定、石蜡包埋.组织切成12 μm厚度，经4%PFA固定、蛋白酶K处理、乙酸酐处理后，杂交液室温封闭1 h，加入地高辛标记的RNA探针在65 ℃条件下孵育过夜.寡核苷酸引物根据小鼠cDNA通过PRIMER3软件设计：Riok3For: 5’-ACCCCTCAAAACACAGTATCC；Riok3Rev: 5’-GTTCCTTCTTCTCGTGTAGACG.次日，样品分别经SSC、Tris-HCl缓冲液浸洗，加入偶联碱性磷酸酶的抗地高辛的抗体经4 ℃孵育过夜后再次用Tris-HCl缓冲液浸洗，最后加入底物BM Purple(Roche，11442074001)显色，在PBS缓冲液中终止反应，加伊红对染，中性树脂封片、拍照.

1.2.2 免疫组化

收集野生型C57BL/6J雌性小鼠P1、P3、P5的卵巢，通过4%PFA固定、石蜡包埋.组织切成5 μm厚度，经脱蜡水化、高压抗原修复、H2O2处理、0.1%PBS-Triton X-100清洗、5%BSA室温封闭后加入一抗Riok3单克隆抗体(proteintech，13593-1-AP)，4 ℃孵育过夜.次日加入二抗，经DAB 显色(VECTOR，SK-4100)、快红对染后中性树脂封片、拍照.

1.2.3 基因打靶载体的构建

以基因打靶的干细胞基因组DNA为模板，在Riok3基因起始密码子上游扩增4 kb作为同源重组的长臂(5’arm)，在起始密码子下游扩增2.5 kb作为同源重组的短臂(3’arm)，分别进行TA克隆.然后通过酶切、连接的方法将两个片段整合到含有Neo(指新霉素抗性基因，选择性筛选的阳性标记)和DTA(指白喉毒素A亚基的负性筛选标记)筛选基因的打靶载体内，其中LoxP-LoxP-Neo(LoxP指Cre-Loxp重组酶系统中在外显子两侧的序列)位于两个重组臂的中间.构建成功的载体进行测序，测序正确后用Qiagen的无内毒素质粒抽提试剂盒进行质粒抽提.

1.2.4 胚胎干细胞基因打靶

用限制性内切酶Pac Ⅰ(NEB，#R0547L)将300 μg基因打靶载体线性化，经过酚-氯仿纯化后用于胚胎干细胞基因打靶.复苏MEF和NeoR MEF细胞，用丝裂霉素C处理的MEF细胞作为基因打靶ES细胞的饲养层细胞，在ES细胞生长至指数生长期时用于基因打靶实验.将收集的ES细胞与线性化的打靶载体DNA混合、静置，转移至电击杯中，用伯乐电击仪电击，冰上静止后，铺到含有NeoR MEF的培养皿中，从第2天开始，细胞每天换含有G418(Sigma，A1720-5G)的新鲜培养基.G418筛选的第8天，挑单克隆.在解剖镜下选取饱满的、边缘清晰的细胞集落，挑至96孔板中.

1.2.5 胚胎干细胞阳性克隆筛选

将96孔板胚胎干细胞单克隆用碱裂解法提取基因组DNA，并用乙醇沉淀，以得到的基因组DNA为模板，用PCR的方法进行胚胎干细胞阳性克隆筛选.为鉴定5’arm 是否重组，将正向引物设计在基因组上5’arm 上游200 bp 以外，反向引物设计在基因打靶载体5’arm 的下游；为鉴定3’arm 是否重组，正向引物设计在打靶载体3’arm 的上游，反向引物设计在基因组上3’arm 下游200 bp以外.只有当两个PCR条带大小都正确，才可以确定这些克隆发生了同源重组，作为阳性克隆.

1.2.6 基因打靶小鼠模型的构建

1.2.6.1 超数排卵

向供体雌鼠腹腔注射孕马血清促性腺激素(pregnant mare serum gonadotropin，PMSG)10 IU，46～48 h后再注射人绒毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin，HCG)5 IU.随后将其与雄鼠合笼过夜，次日清晨7：00检查阴栓(见栓后标记为E0.5).

1.2.6.2 囊胚的获取

小鼠见栓后第3天(E3.5)，用1 mL注射器抽取冲卵液，将针头插入输卵管子宫体结合处，将子宫置于培养皿中并进行冲洗.将冲出的液体在体视显微镜下进行观察，用移卵针捡出发育阶段和质量较好的胚胎进行实验，一般选用桑葚胚到囊胚期的胚胎.

1.2.6.3 显微注射

用嘴控移卵管转移胚胎至显微镜台上的注射操作室，固定住囊胚，将具有内细胞团(inner cell mass，ICM)的胚胎放在6点或12点位置，瞄准后注射针快速准确地穿过透明带，慢慢地释放ES细胞进入囊胚腔，再慢慢抽出注射针.定期把注射过的胚胎转移到二氧化碳培养箱里，于M16培养基中培养.

1.2.6.4 胚胎移植

麻醉受体假孕母鼠，暴露受体雌鼠子宫，将注射ES细胞的胚胎吸入移卵针，在输卵管子宫结合部几毫米处避开血管开孔，将囊胚吹入子宫.术后将小鼠放置于干净的鼠笼里，用50 W的灯泡保温，并放在保温台上，直到其苏醒.

1.2.7 嵌合体小鼠的判定与交配

胚胎移植后21 d左右小鼠产仔，10 d左右可根据毛色显性判断其是否为嵌合体(chimera)以及嵌合率情况.将雄性嵌合体小鼠与C57BL/6J野生型小鼠交配，后代通过基因型鉴定，含有目的基因片段的杂合子小鼠为构建成功的Riok3条件基因打靶小鼠F1代.

2 结果及分析

2.1 原位杂交实验检测Riok3在小鼠卵巢中的表达

通过Riok3mRNA基因编码序列的原位杂交实验，发现在P1、P3和P5小鼠的卵母细胞中Riok3均有特异性的表达(图2).故推测Riok3基因可能参与小鼠卵泡的发育过程，进而参与卵巢发育.

注:箭头表示卵母细胞.图2 原位杂交实验检测Riok3在小鼠卵巢中的表达Fig.2 Detection of Riok3 expression in mouse ovary by in situ hybridization注:箭头表示卵母细胞.图3 免疫组化检测Riok3在小鼠卵巢中的表达Fig.3 Immunohistochemical assay of Riok3 expression in mouse ovary

2.2 免疫组化实验检测Riok3在小鼠卵巢中的表达

对P1、P3和P5的小鼠卵巢进行Riok3抗体的免疫组化实验，结果显示，Riok3在出生后小鼠第1、第3和第5天的卵巢卵母细胞中都有明显信号(图3)，表明Riok3参与卵泡的发育过程，进而参与卵巢发育.

2.3 Riok3基因打靶的载体构建及基因打靶

将成功构建的Riok3条件基因打靶质粒线性化后，经胚胎干细胞的基因打靶，利用PCR方法筛选阳性重组克隆.3’同源臂鉴定PCR长度为3.9 kb，5’同源臂鉴定的长度为5 kb，打靶载体构建如图4所示.经琼脂糖凝胶电泳图显示，E号克隆为阳性克隆(图5).

注：E1—E6表示外显子1—6.

a b

2.4 Riok3基因打靶小鼠模型构建

图6 显微注射原理图

将得到的阳性干细胞进行囊胚显微注射、胚胎移植，得到嵌合体小鼠(图6).本研究经胚胎移植的代孕母鼠共4只，最终得到3窝存活的嵌合体小鼠共12只.根据毛色挑选嵌合率较高的雄性嵌合体小鼠4只与C57BL/6J雌鼠进行交配，得到F1代小鼠.收取其尾部组织，经过碱裂解法提取基因组DNA，通过琼脂糖凝胶电泳进行基因型鉴定.阳性条带大小为246 bp，野生型条带大小为147 bp.Riok33 LoxP鉴定For1：AGCTTTAGCGTCTGACTGG；Riok33 LoxP鉴定Rev1：TGAGTGCTTTTTTGAGTGTCC.实验结果显示2、3、6、7、8、9、10、13和16号为杂合子小鼠，其余均为野生型小鼠(图7).

1～17：F1代小鼠代号；M：电泳marker.

3 讨论

蛋白激酶在体内信号转导中扮演着重要的角色，其中Riok3被发现在真核生物中参与细胞周期过程中核糖体的生物合成[12,16].Riok3mRNA基因编码序列的原位杂交实验和Riok3抗体的免疫组化实验均发现Riok3在P1、P3和P5小鼠卵巢卵母细胞中高表达，表明Riok3可能参与小鼠卵母细胞的发育过程.为此，本研究构建了Riok3条件基因打靶载体，通过基因打靶、干细胞囊胚注射和胚胎移植，得到了Riok3条件基因打靶的嵌合体小鼠.至此，成功构建Riok3条件基因打靶的小鼠模型(Riok3loxP/loxP).

接下来可将Riok3loxP/loxP基因型小鼠与在卵母细胞中特异性表达的GDF9-Cre基因型小鼠杂交，以获得卵母细胞中特异性敲除Riok3的突变型小鼠(Riok3loxP/loxP/GDF9-Cre)，进一步研究Riok3在卵母细胞发育中的功能，深入了解Riok3在卵巢发育过程中的分子调控机制.