EDTA与EM复合菌剂联合对铅胁迫下黑麦草种子萌发、幼苗生长及铅吸收的影响

周红艳 陈丽珊 朱 瑛

（福建农业职业技术学院 福建福州 350119）

随着我国工农业化的快速发展，铅污染日益严重，对人类生存和健康造成了严重影响，已成为当今急需解决的重要环境问题。

植物修复技术已为环境中重金属修复开辟了新的途径，因其具有原位、经济、环保、二次污染小等优点而被广泛采用[1]。研究发现，草坪草作为应用较广的绿化植物，具有生长快、适应性强、生物量大、抵抗力和固土力强的特点。因而对重金属污染地区的污染修复，较其他物种更易达到去除效果，且吸收的重金属更多，处理效率更高[2]。

植物提取修复技术主要通过收获富集重金属的植物而将重金属带出，从而降低环境中的重金属含量。但是植物修复技术主要受限于植物生物量小、生长速度慢和重金属有效性低而无法被植物吸收利用等问题[3]。若向土壤中添加人工合成的螯合剂，则可以活化污染土壤中的重金属，增加土壤溶液中重金属浓度。大量研究表明，可以通过物理、化学、微生物等辅助措施克服其修复过程中的限制因素，从而有效提高植物修复效率；螯合剂能不同程度地活化土壤中的重金属并促进植物对其超量吸收[4,5]。螯合剂的剂量，使用方式、施用阶段等都成为研究的热点。杨卓通过盆栽试验研究乙二胺四乙酸（EDTA）对印度芥菜修复镉污染土壤的增效作用，研究表明，EDTA 的施入使得芥菜吸收镉的量明显增加[6]。白薇扬研究生物螯合剂EDDS 与非生物螯合剂EDTA联合施用对玉米和油料作物重金属铅、铜、镉的富集程度，表明螯合剂能够增加植物中重金属的富集，不同配比的生物螯合剂与非生物螯合剂效果不同[7]。EDTA可以阻止金属的沉淀，使大量的重金属进入土壤溶液，同时，以金属螯合物的形式保护金属不被土壤重新吸附[8]。Luo C 等研究发现，在土壤中添加EDTA 48 小时后，污染土壤中溶解性的铜、锌、铅、镉含量分别比对照增加了102 倍、496 倍、114 倍和5 倍[9]。

降低重金属对植物毒性和提高植物对重金属的耐性，从而提高植物生物量是增强植物进行重金属修复的重要途径。EM 复合菌剂是日本琉球大学比嘉照夫教授研制出来的一种复合微生物制剂，由光合菌、乳酸菌、酵母菌等 80 多种厌氧性或嫌氧性微生物复合培养而成，不含任何化学有害物质，不污染环境。对于EM 复合菌剂降低动植物内重金属已有较多报道。施用EM 复合菌剂可以达到对低浓度重金属污染土壤进行微生物修复、降低重金属含量、促进植物生长、提高植物抗性的目的[10-14]。梁小迪等采用盆栽试验方法，研究了耐性细菌与活化剂（有机肥、EDTA、黄腐酸、柠檬酸）对黑麦草吸收镉的影响，耐镉菌剂与活化剂可提高镉生物有效性、提高黑麦草对镉污染土壤的生物修复效果，具有较好的应用推广前景[15]。可见，采用EM 复合菌剂与非生物螯合剂EDTA共同诱导植物修复重金属污染是一个值得探讨的问题。

为此，本研究将探讨EM 复合菌剂与非生物螯合剂EDTA 联合施用对铅胁迫下黑麦草种子萌发、幼苗生长及铅吸收的影响。但至今为止，利用EM 复合菌剂与非生物螯合剂EDTA联合施用对铅污染的黑麦草修复效应方面的研究应用国内鲜见报道。且目前大部分种子萌发阶段的研究都只是对于种子幼苗生长、发芽率等的研究，对重金属吸收情况研究极少，EM 复合菌剂与非生物螯合剂EDTA 之间是否存在交互作用尚不清楚。为了更好地将生物与非生物措施相配合，因此开展了EM 与EDTA 联合修复铅的研究，旨在为合理进行植物—微生物—化学联合修复重金属污染提供技术支撑和科学依据。

1 试验材料与方法

1.1 供试材料

由千聚源种业公司提供黑麦草种子，江西天意生物技术有限公司提供EM 复合菌剂，天津市化学试剂批发公司提供EDTA（乙二胺四乙酸二钠盐）。

1.2 种子培养与试验设计

1.2.1 种子培养

选取直径为9 cm 的培养皿，以相应大小的二层滤纸作为发芽床，将配制好的不同浓度EM 溶液和EDTA 溶液倒入培养皿，对照（CK）不加EDTA 和EM，用水替代，保证每个培养皿内硝酸铅浓度为200 μg/mL。每日称重法加水至恒重，培养温度为25 ℃，光照、黑暗周期分别为16 h、8 h。每个培养皿放入100 粒种子（试验前将黑麦草种子用0.5%次氯酸钠消毒1 h，用无菌水冲洗干净，滤纸吸干，挑选颗粒饱满的种子）。

1.2.2 试验设计

试验按2 因素3 水平随机区组设计。因素1 为EM 溶液浓度，设低、中、高3 个水平，分别为EM0（0）、EM1（450 倍）、EM2（150 倍），表3中用E0、E1、E2 表示。因素2 为螯合剂EDTA 溶液浓度，设低、中、高3 个水平，分别为EDTA0（0）、EDTA1（5 mmol/L）、EDTA2（10 mmol/L）），表3中用A0、A1、A2 表示。共设9 个处理，每个处理设置3 个重复。2 因素水平如表1所示。

表1 因素及其水平

1.3 种子发芽、幼苗生长统计方法

每天观察生长情况，第十天统计发芽率 （胚根长须达到种子长度一半才能计入）、第三天统计发芽势。

发芽率=（第10 天正常发芽种子数/供试种子数）×100 %。发芽势=（第3 天正常发芽种子数/供试种子数）×100 %。第10 天测量幼苗的根长、芽长，每个培养皿随机选取10 株测定取平均值，地上部鲜重每个处理取地上部分分别称重。

1.4 铅含量原子吸收分光光度测定法

1.4.1 标准曲线绘制

用10 μg/mL 硝酸铅标准溶液配制成浓度为0 μg/mL、1.00 μg/mL、2.00 μg/mL、3.00 μg/mL、4.00 μg/mL、5.00 μg/mL 的标准溶液，参照液体类样品铅含量检测国标GB5009.12—2017 第三法火焰原子吸收法，用MIBK 萃取铅导入火焰原子吸收分光光度计进行测定，按浓度与吸光度对应关系绘制标准曲线，曲线方程为y=0.0245 x+0.0362 。

1.4.2 样品测定与仪器条件

第十天每个培养皿吸取0.3 mL 溶液与标准溶液相同方法进行铅含量检测。使用TAS-990 F 北京普析火焰原子吸收分光光度计，仪器工作条件如下：燃气组成为空气-乙炔；检测波长为283.3 nm；灯电流为2 mA；乙炔流量为1 200 mL/min；空气流量为8 L/min。

1.5 数据处理与分析

试验所得数据用Excel 2016 进行初步处理，用SPSS 软件进行方差分析和多重比较，P＜0.05 表示差异达显著水平，P＜0.01 表示差异达极显著水平。

2 结果与分析

表2 不同指标方差分析F 值

从表2可以看出，EM 复合菌剂与螯合剂EDTA 单因子及二因子（EM×EDTA）互作对黑麦草（芽长、根长、鲜重）和发芽势、发芽率、铅含量影响达显著（P＜0.05）和极显著水平（P＜0.01）（除EM×EDTA 对发芽势影响差异不显著外）。EM×EDTA 处理组合产生互作效应，下面进行单因素及二因子互作效应分析。

2.1 不同EM 与EDTA 处理浓度对铅胁迫下黑麦草芽长、根长、鲜重、发芽势、发芽率和铅含量影响的单因素效应

由图1至图6可以看出，不同浓度EM 处理对黑麦草芽长、根长、鲜重、发芽势、发芽率的影响均以稀释150 倍处理最大，且3 种浓度EM 处理水平均呈EM1 （150 倍）＞EM2（450 倍）＞EM0（0，CK）的变化趋势，铅含量表现趋势相反。其中EM1 （150 倍）处理与EM2（450 倍）、EM0（0，CK）处理间差异分别达极显著水平P＜0.01。EM1（150 倍）处理与EM0 对照相比，芽长、根长、鲜重、发芽率增幅分别达18.7%、34.5%、44.4%、31.7%，铅含量下降了16 %。说明使用EM 菌剂促进了黑麦草种子的萌发与生长，同时使得铅浓度下降，有利于环境中铅的修复。

不同浓度EDTA 处理对黑麦草种子萌发和幼苗生长的影响可以从芽长、根长、鲜重、发芽势、发芽率上反映出来，方差分析结果表明处理间差异达显著P＜0.05或极显著水平P＜0.01。总体表现呈EDTA2（10 mmol/L）＜EDTA1（5 mmol/L）＜EDTA0（0，CK）的变化趋势，铅含量变化趋势与之相反。EDTA 浓度越高对黑麦草的生长及发芽率抑制越大。这与其活化铅的程度密切相关。当EDTA 浓度为5 mmol/L 时，与对照相比，芽长、根长、鲜重、发芽率抑制分别达63.3%、63.8%、74.0%、40.5%，当EDTA 浓度为10 mmol/L 时，芽长、根长、鲜重、发芽率抑制分别达82 %、92 %、92.7%、63.5%。铅含量比对照分别增加了3.39 倍、6.82 倍。当EDTA 浓度为10 mmol/L 时，根长、鲜重极显著下降，其中根长只有0.27 cm，与对照3.37 cm相比较下降了11.5 倍，鲜重下降了12.8 倍，表现出明显的铅危害。因为根是植物体络合重金属重要的部位，也是最易受重金属毒害的部位。根据前人的研究，植物的根系和地上生物量的积累有利于吸收重金属，根长的变化可作为植物受重金毒性影响的一个重要指标[17]。可见在EDTA 浓度为10 mmol/L 时抑制过大。在本试验条件下，EDTA 浓度在5 mmol/L 时，相对有利于铅的吸收，从而达到更好的修复效果。

2.2 EM 与EDTA 互作对铅胁迫下黑麦草芽长、根长、鲜重、发芽势、发芽率以及铅含量的影响

从表3数据可以看出，在同一E（EM）水平下，不同浓度A(EDTA)处理间达极显著水平（P＜0.01），其浓度越高，对黑麦草的生长及发芽率抑制越大，重金属活化程度也越高。虽然A2（10 mmol/L）水平重金属活化达到最大，但是根长、鲜重等与对照相比抑制都达到了十几倍。A1（5 mmol/L）水平与A2（10 mmol/L）水平相比，在相同EM 水平下重金属浓度活化程度虽然下降1 倍多，但是芽长、根长、鲜重、发芽率指标均在2～5 倍之间增长，植物根系与地上生物量是吸收重金属的重要部位，所以EDTA浓度应适当控制在相对合理的浓度，否则不利于植物生长，影响重金属的吸收。

表3 相同EM 水平下，不同EDTA 浓度处理对铅胁迫下黑麦草芽长、根长、鲜重、发芽势、发芽率和铅含量的影响

对于同一A（EDTA）水平下，不同E（EM浓度）处理对铅胁迫下黑麦草芽长、根长、鲜重、发芽势、发芽率的影响（见表3）总体呈E1＞E2＞E0 的变化趋势，而铅含量呈相反的变化趋势。说明EM 浓度150 倍的条件下，对黑麦草芽长、根长、鲜重、发芽势、发芽率的影响差异最大。EM 与EDTA 联合使用与单独使用EDTA 相比，都能够促进黑麦草生长和种子萌发。两种制剂综合作用，使得重金属浓度下降，从而减轻了重金属对黑麦草的毒害作用，有利于重金属污染的修复。

3 结论

综上所述，使用EM 复合菌剂可明显促进黑麦草种子的萌发与幼苗生长，从而更好吸收溶液中的铅，150 倍浓度的EM 有利于环境中铅的吸收。EDTA 浓度越高重金属活化程度越高，但是对黑麦草的生长及发芽率抑制也越大。根系与地上生物量作为吸收重金属的重要部位应考虑其生长受抑制程度，在本试验条件下，EDTA 浓度5 mmol/L 为相对合理的浓度，浓度不宜超过10 mmol/L，否则可能对植物生长和重金属修复带来不利影响。EM 与EDTA 产生明显的交互作用，两者的合理配合使用，能缓解重金属对黑麦草的毒害作用，有利于重金属污染的修复。综合考虑，以喷施150 倍EM 菌剂及5mmol/L 的EDTA 混合剂处理效果最佳。

黑麦草的苗期生长与其生理响应息息相关，进一步分析植物体内重金属的变化可以更加清楚了解重金属的动态变化及产生的生理机制。但是本研究在苗期阶段受到重金属胁迫部分处理样品量不足，后续应通过盆栽及田间种植等进行进一步研究。

4 讨论

在本实验中，EM 菌剂可以促进黑麦草的生长和种子的萌发，溶液中铅浓度下降，说明使用EM 复合菌剂可以达到铅污染的微生物修复目的，这可能与黑麦草地下部和地上生物量的增加有关。植物生物量低，特别在种子萌发期生长缓慢，对铅的耐受性有限。通过植物促生菌可促进植物生长，提高植物耐受性，从而达到重金属污染修复的目的，这与前人的观点一致[18,19]。

作为一种被广泛应用的重金属植物—微生物—化学联合修复方法，黑麦草对重金属的富集能力有限。而EDTA可以在不同程度活化重金属的同时诱导植物对重金属的超量吸收[20]。不过浓度过高也可能抑制植物生长，对重金属污染修复产生不利[21]。因此，本实验中对黑麦草生长中同时使用增强重金属耐性的EM 复合菌，试验可行且具有一定的创新性，为进一步进行盆栽及大规模试验提供理论支撑。但是，虽然诱导植物提取重金属的研究在实践应用中拥有很好的潜力，且生态风险相对更小，但仍应充分考虑到EDTA对重金属的植物修复受各种因素的影响，如植物品种、环境中重金属污染状况和其本身特性，以及EDTA的过量使用可能造成的二次污染等。与此同时，对于能促进黑麦草对重金属铅吸收的微生物，应加强EM 复合菌群中更多功能菌的筛选和功能特点的深入研究，从而建立一条有效的植物—微生物—化学修复重金属污染途径。