CMTM5基因与冠状动脉粥样硬化性心脏病的关联研究及机制探讨

刘滕飞，林 涛，任利辉，李广平，彭建军

(首都医科大学附属北京世纪坛医院心血管内科，北京 100034)

在我国，冠状动脉粥样硬化性心脏病(简称冠心病)的发病率及死亡率逐年升高，已成为影响人类健康的最重要疾病之一。动脉粥样硬化是冠心病发生的重要病理基础，目前认为，动脉粥样硬化是一种以具有免疫活性的单核细胞浸润为特征的动脉壁的慢性炎性疾病[1-2]。单核细胞的募集是一个关键环节，单核细胞可黏附于血管内膜向内皮细胞(endothelial cells，ECs)下间隙迁移，分化成为巨噬细胞进而吞噬氧化低密度脂蛋白形成泡沫细胞[2-3]。近年的研究结果提示，单核细胞的募集由趋化因子及其G蛋白偶联受体调控[4]。血液循环和动脉壁中趋化因子的上调在白细胞募集、早期动脉炎症和动脉粥样硬化形成及斑块不稳定等方面发挥重要作用[5-7]。因此，针对冠心病发病机制进行探讨，及早预防和及早干预是当今基础研究领域的重中之重。

趋化素样因子超家族成员5(CKLF-like MARVEL transmembrane domain containing member 5，CMTM5)是趋化素样因子家族的第5个成员，该基因定位于14q11.2，位于白细胞介素25编码基因下游，与其紧密连锁。CMTM5由北京大学人类疾病基因研究中心在国际上首次报道，其编码的产物具有潜在四次跨膜蛋白结构，且存在分泌蛋白形式，CMTM5由6个外显子和5个内含子组成，广泛表达于正常成人和胎儿组织内[8]。研究表明，CMTM5与肿瘤发生、发展、侵袭等生物功能密切相关，是有潜在应用价值的抑癌分子。Voora等[9]的研究发现，CMTM5基因表达量的变化与心血管事件的发生风险紧密相关。本课题组既往的研究结果表明，CMTM5基因与冠心病患者服用抗血小板药物期间血小板高反应性及支架术后患者心血管事件的发生风险密切相关[10]，但对动脉粥样硬化和冠心病的发生发展及相关机制尚未进行探讨。

本研究通过测定人群中CMTM5水平，探讨CMTM5与动脉粥样硬化、冠心病发生发展的相关性，同时观察CMTM5表达量变化对THP-1向ECs黏附和迁移能力的影响。本研究通过在基因及细胞学水平阐明CMTM5在动脉粥样硬化中的作用，以期为抑制动脉粥样硬化、阻止冠心病的发生及防治研究提供依据。

1 资料与方法

1.1 研究对象

入选2015年1月至2017年12月在首都医科大学附属北京世纪坛医院心内科接受住院治疗并行冠状动脉造影检查的患者共700例，其中男400例、女300例，平均年龄(58.1±7.6)岁。所有入选者均在我院接受冠状动脉造影检查。冠心病诊断标准：冠状动脉造影证实左前降支、左回旋支、右冠状动脉及主要分支中至少一支主要冠状动脉直径狭窄达50%以上。排除标准：患有肝、肾、甲状腺、血液系统疾病及肿瘤的患者,或存在炎症、感染或自身免疫系统疾病、1型糖尿病及家族性高脂血症的患者。

1.2 血样品采集、基因组RNA提取及逆转录-聚合酶链反应(reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR)

空腹状态下抽取研究对象外周血5 mL，加入含EDTA的真空抗凝管中，室温3 000 r/min离心20 min，分离血浆，多管分装保存，于-80 ℃低温冰箱保存，剩余血液置-20 ℃冰箱储存备用。分装的部分血浆用于测定入选患者血浆中CMTM5水平。

采用Trizol法提取细胞RNA，采用紫外分光光度法对提取的总RNA浓度进行测定，逆转录合成cDNA，反应条件为：25 ℃ 5 min，42 ℃ 1 h，70 ℃ 7 min，40 ℃ 10 min。行定量PCR反应，溶解曲线为：95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 30 s，60 ℃ 15 s。取5 μL的RT-PCR产物与1 μL的溴酚蓝溶液混合，经1.5%(质量分数)琼脂糖凝胶电泳鉴定，150 V电压下电泳40 min，电泳结束后在凝胶成像系统紫外光照射下进行检测。

1.3 酶联免疫吸附测定法(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)检测血浆中CMTM5表达量

将患者的血浆样本与样本稀释液以体积比为1 ∶5稀释，用倍比稀释的方法制备标准品，浓度梯度分别为300、200、100、50、25 μg/L。每孔加入50 μL血浆稀释液，封板膜封板，37 ℃温育30 min，洗板，弃去废液，每孔加入300 μL洗板液，拍干，反复洗板5次，向各孔中加入酶标试剂50 μL(空白孔除外)，温育，洗涤方法同前，最后加入50 μL显色剂A及显色剂B，震荡混匀，37 ℃避光显色15 min，每孔加入50 μL终止液，此时蓝色立转黄色，空白孔为调零，酶标仪450 nm处读数。

1.4 ECs培养和转染、稳定转染细胞株筛选及THP-1细胞培养

选取EA.hy926血管ECs系进行研究，此细胞系为人脐静脉ECs融合细胞，与原代脐静脉ECs的生物学功能相似，该细胞系相对好培养，培养条件为10%(体积分数)DMEM培养基，37 ℃、5%(体积分数)CO2培养箱，0.25%(质量分数)胰蛋白酶37 ℃消化1 min，轻轻晃动，待细胞皱缩变圆时，加入等体积的培养液终止消化，轻轻吹打混匀，1 ∶3比例进行传代。传代与冻存同时进行，冻存条件为10%(体积分数)二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)溶液，放置于液氮中保存。

转染及稳定转染细胞株筛选：本研究所用的过表达CMTM5的腺病毒由山东维真生物科技有限公司包被，低表达CMTM5的慢病毒由北京普瑞金生物科技有限公司包被。在6孔板每孔中接种1×105ECs，当细胞融合度接近70%时，12 h后转染目的质粒，24 h后在荧光显微镜下观察转染效率，转染效率在90%以上。根据病毒载体抗性，加入G418进行稳定转染细胞株的筛选，G418对ECs的最小致死浓度为350 μg/L，10 d左右挑出单克隆进行培养，Western blot验证结果。

THP-1细胞购买自美国ATCC公司，以0.5×106接种于含有10%(体积分数)胎牛血清的RPMI1640培养液的培养瓶中，3 d后收集细胞培养液至15 mL离心管中，700 r/min离心5 min，弃去上清液，用吸管轻轻吹打制成均匀的细胞悬液，1 ∶3比例传代接种于培养瓶中继续培养。

1.5 细胞黏附实验

将1×105ECs接种于6孔板中，当细胞长至2×105时进行下一步实验。收集THP-1细胞至15 mL离心管中，700 r/min离心5 min，加入2 mL含10%胎牛血清的RMPI1640培养液，加入15 mL/L钙黄绿素，37 ℃避光孵育30 min，磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffer saline，PBS)清洗THP-1细胞3次，细胞计数后，取2×105的THP-1细胞均匀铺至已弃掉培养液的接种好ECs的6孔板中，37 ℃避光孵育2 h，吸去培养液，以PBS轻轻冲洗3遍，加入少量培养液，于荧光倒置显微镜(Olympus Ⅸ-70)进行结果统计。

实验分为5组：第1组为正常ECs组(non-infected ECs，EN组)， 第2组为过表达CMTM5ECs组(CMTM5overexpression ECs，EO组)， 第3组为过表达CMTM5对照组(lenti-mock infected ECs，EO-MOCK组)， 第4组为低表达CMTM5ECs组(CMTM5suppression ECs，ES组)， 第5组为低表达CMTM5对照组(lenti-mock infected ECs，ES-MOCK组)。

是的，我曾在同一天里，撰写两篇不同的文章，一边同情社会革命党，一边拥护黑帮分子。 而且我对这两派都信服。 难道革命中就没有百分之一的真理？难道黑帮的反革命中就没有百分之一的真理？[4]160

1.6 细胞迁移实验

计数5×104个ECs接种于Transwells下室中，培养液加至600 μL，当ECs完全贴壁后进行下一步实验。取5×104个THP-1细胞接种于Transwells上室中，培养液加至200 μL，37 ℃培养12 h，取出上室，10%(体积分数)多聚甲醛溶液中固定30 min，棉签轻轻擦拭上室内侧后行姬姆萨染色(Giemsa stain)：Transwells上室浸泡于姬姆萨A液与B液1 ∶1比例的混合液中15 min，取出Transwells上室，浸泡于姬姆萨A液与B液1 ∶3比例的混合液中5 min，PBS冲洗Transwells上室3次，置于显微镜下(Leica DM3000)进行结果统计，实验分组同细胞黏附实验。

1.7 统计学分析

采用SPSS 17.0软件进行统计分析，两组间计量资料用均数±标准差表示，t检验进行统计分析，计数资料用百分数表示，以χ2检验计算结果。采用GraphPad Prism 5.0软件对黏附和迁移实验结果进行统计图表分析及绘图。双侧P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 基本资料

本研究共入选700例患者，其中冠心病患者350例，对照组350例，所有入选研究对象的临床基线资料见表1。两组患者的性别、年龄、体重指数等一般资料差异均无统计学意义(P>0.05)，糖尿病、高血压患病率在冠心病组和对照组间差异有统计学意义(P<0.05)。实验室检查提示，吸烟因素、甘油三酯、总胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇在两组间差异有统计学意义(P<0.05)。

表1 CAD组和对照组的临床基线资料Table 1 Baseline characteristics of the patients in CAD group and control group

2.2 CMTM5 mRNA和血浆蛋白水平与冠心病的相关性分析

冠心病组患者CMTM5基因mRNA表达量是对照组表达量的3.45倍，明显高于对照组(P<0.05，图1A)。

血浆CMTM5蛋白水平在两组间的比较与其mRNA表达量在两组间的比较趋势一致，冠心病组患者血浆CMTM5蛋白平均水平为(206.1±26.9) μg/L,明显高于对照组的(125.3±15.2) μg/L(P<0.05，图1B)。

2.3 影响冠心病发生风险因素的Logistic回归分析

采用Logistic回归分析两组的年龄、性别、体重指数、吸烟、高血压、糖尿病及高脂血症等冠心病易患因素，结果提示CMTM5基因、年龄、性别、吸烟、高体重指数、高血压、糖尿病、高脂血症与冠心病发生风险密切相关(P<0.05，表2)。

表2 Logistic回归分析冠心病的易感因素Table 2 Logistic regression analysis of coronary artery disease risk factors

2.4 细胞黏附实验

黏附实验结果如图2所示，过表达CMTM5基因ECs组(EO组)中THP-1细胞黏附数量明显高于对照组(EO-MOCK组)、正常细胞组(EN组)和CMTM5低表达的ECs组(ES组)，差异有统计学意义(P均<0.01)，ES组THP-1细胞黏附数量明显低于EO-MOCK组、EN组和EO组(P均<0.01)。以上结果提示，CMTM5基因过表达能够促进THP-1细胞向ECs黏附，相反CMTM5基因低表达抑制THP-1细胞向ECs黏附。

2.5 细胞迁移实验

3 讨论

动脉粥样硬化是冠心病的病理基础，是动脉壁的一种慢性全身性炎性疾病，这种慢性炎症反应学说已经被多数学者的研究所证实。血管内皮损伤、血小板黏附聚集、单核细胞募集至血管壁是动脉粥样硬化的早期特征。单核细胞分化成为巨噬细胞，吞噬胆固醇(主要是氧化低密度脂蛋白)后变成泡沫细胞，分泌活性氧、脂质介质和各种炎性细胞因子，从而导致更多的单核细胞以及T细胞和B细胞进入动脉粥样硬化病变区域，这种慢性炎症反应持续存在导致动脉粥样硬化斑块不断发展，最终突出于管腔的斑块和破裂的不稳定斑块阻断冠状动脉正常的血流，导致心绞痛、心肌梗死、中风等心血管事件的发生。

近年来众多研究表明，炎症细胞向血管壁的募集依赖于趋化因子及其相应的G蛋白偶联受体。趋化因子是一类小分子量的细胞因子家族，通过募集血液中的各类炎症细胞，例如单核细胞、淋巴细胞、中性粒细胞等进入受损或感染组织，在炎症、血管生成、艾滋病、肿瘤等多种病理生理过程中发挥着重要作用[11-15]。

冠心病是一种由遗传因素和环境因素共同作用和调控的多因素疾病，Lundberg等[16]的研究结果提示，趋化因子CXCL16与冠状动脉病变程度相关，Singh等[17]的研究发现，CX3CR1使冠心病早发风险增加1.53倍，Cai等[18]的研究结果提示，CCL19、CCL21与动脉粥样硬化和冠心病的发生发展密切相关，并参与平滑肌细胞表型转换。

CMTM5最早在肿瘤领域被发现，参与肿瘤细胞的增殖、黏附和迁移等生物学行为，是一个具有潜在价值的肿瘤抑制基因，在心血管领域鲜有研究报道。本课题组既往的研究表明，CMTM5基因rs723840多态位点与冠心病密切相关，CMTM5与冠心病患者支架术后血小板高反应性密切相关，与心血管事件发生风险密切相关，CMTM5基因低表达促进受损伤的人血管ECs的增殖和迁移，促进受损伤的血管ECs完整性的修复[10,19]。本研究对CMTM5基因与冠心病的关联进行了分析并探讨相关机制，研究结果表明，冠心病患者CMTM5基因mRNA及血浆CMTM5蛋白水平明显高于对照组，CMTM5基因过表达促进THP-1细胞向ECs黏附和迁移，本结果同既往研究结果一致，均提示CMTM5基因过表达能够促进动脉粥样硬化及冠心病的发生发展。CMTM5基因促进THP-1黏附、迁移能力的机制可能为CMTM5与白细胞介素(interleukin, IL)-25紧密连锁，这两个基因在功能上有一定的相关性，存在趋化作用，以及CMTM5编码的产物结构更接近于四次跨膜蛋白超家族，与β3整合素形成复合物，调控整合素依赖的细胞移动和黏附，因此调控细胞的增殖分化、黏附、迁移等多种生物学行为。本研究为CMTM5基因与冠心病发生风险的相关性又增加了一项基础研究证据。