母体胚胎亮氨酸拉链激酶与妇科恶性肿瘤的相关研究

张钗红，全昱冲，关德凤，杨永秀

随着肿瘤驱动基因[1-2]和癌症生物学的深入研究，多组学整合工具[1-2]和智能数字系统[3]等精准医疗技术的飞速发展，靶向药物临床试验[4]和耐受研究[5]的广泛开展，肿瘤研究已进入驱动基因精准诊断和靶向干预新时代。人类母体胚胎亮氨酸拉链激酶(maternal embryonic leucine zipper kinase， MELK)是蔗糖非发酵-1/磷酸腺苷依赖蛋白激酶相关激酶家族成员之一，是鼠人类丝/苏氨酸蛋白激酶38(murine serine-threonine protein kinase 38， MPK38)和非洲爪蟾蛋白激酶Eg3的直系同源物。MELK作为一种重要的肿瘤驱动基因，以激酶依赖的方式参与调控细胞周期[6]、增殖[7]、分化[7]、有丝分裂[8-9]、凋亡[6]、细胞骨架[10]、细胞内信号传导[11]、癌细胞干性[12]、DNA损伤修复[13]和翻译后修饰[6]等多种生物过程，在妇科主要恶性肿瘤的形成和进展中发挥重要作用。本文就MELK的结构、功能、作用机制及其与妇科主要恶性肿瘤的关系进行综述如下。

1 MELK概述

1.1MELK发现、定位和结构 1997年Heyer等[11]使用差异显示技术鉴定小鼠胚胎植入前阶段优先转录基因时发现一种新的母本转录基因——MELK。检索NCBI基因数据库，人类MELK定位于染色体9p13.2。

MELK的结构：Ser/Thr激酶催化域包括N端半段结构(非经典泛素化结构域结合位点)[14]、C端半段结构(与底物结合有关，参与激酶活化和活性调节)[14]、铰链区[15]和三磷酸腺苷(ATP)结合位点[14-15]。非经典泛素化结构域包括调节激酶活性和维持激酶域的正确构象[14]。C端调节区域包括TP二肽富集区(含多个磷酸化位点)和激酶相关区域1[14-16]。

1.2MELK激活和作用机制 未磷酸化MELK的C端半段结构T-环中存在分子内二硫键，不吸收外源底物，还原剂等可破坏二硫键，实现Thr167的自身磷酸化活化MELK[14,16]。MELK活性的影响因素：MELK自身磷酸化、外源底物磷酸化、还原或氧化状态、分子内二硫键及钙离子剂量等[14]。MELK激活后可通过直接结合和底物磷酸化与蛋白质靶标发生相互作用调控线粒体、凋亡、丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)[17]、丝氨酸-苏氨酸激酶受体相关蛋白(STRAP)/转化生长因子-β(TGF-β)[18]、JNK-cJUN、雌激素受体[19]、FAK/Paxillin[10]等信号通路发挥生物学功能[14]。Gong等[18]在结直肠癌组织中发现，MELK可特异性结合STRAP,具有较强的致癌潜力。Liu等[7]在髓母细胞瘤中发现，MELK结合并诱导Zeste基因增强子同源物2(EZH2)磷酸化调节癌干样细胞增殖。

2 MELK与肿瘤

2.1MELK与肿瘤促进 MELK作为一种重要的肿瘤驱动基因，参与维持肿瘤起始细胞的生长，促进肿瘤发生[20]，在神经母细胞瘤[21]、桥脑胶质瘤[22]、肾上腺皮质癌[23]、乳腺癌[19]、胃癌[10]和结直肠癌[18]等大多数癌症中均呈显著高表达，MELK高表达与更强的瘤体形成能力显著相关[12]。MELK为肿瘤细胞提供生长优势[24],促进其生物学进展，促进肿瘤细胞增殖、侵袭和转移，MELK高表达与肿瘤分期[18,21,25]、淋巴结转移[18]、治疗后复发[26]及患者预后不良[7,21,25]显著相关。

2.1.1MELK促进肿瘤细胞增殖：MELK主要通过调控肿瘤细胞周期和凋亡促进增殖。Wang等[17]在人视网膜细胞瘤中发现，MELK联合FoxM1的过表达可显著降低经科罗索酸处理后显著上调的Y-79细胞的G2/M期细胞数量和凋亡细胞百分比，有效逆转细胞周期阻滞和细胞凋亡，促进增殖。Li等[19]在三阴性乳腺癌(TNBC)细胞中通过沉默MELK导致G2停滞，Cyclin B和Cyclin D1表达显著下调，抑制增殖。

2.1.2MELK促进肿瘤细胞侵袭和转移：MELK促进肿瘤细胞侵袭、迁移、腹膜转移和淋巴结转移。MELK敲低可抑制FAK和Paxillin的磷酸化,显著减少迁移和侵袭的胃癌细胞数量[10]。MELK过表达可显著增加胃癌移植瘤裸鼠腹膜内结节数量，促进腹膜扩散和转移[10]。Gong等[18]在结直肠癌中发现，MELK高表达组较低表达组更易发生淋巴结转移。

2.2MELK与肿瘤治疗

2.2.1MELK抑制剂：MELK抑制剂可靶向干预高度增殖的肿瘤细胞及其来源的肿瘤干细胞用于肿瘤治疗[24]。高通量筛选：Chung等[20]使用IMAP法筛选AMRI化合物库发现最有效的MELK抑制剂OTSSP 167，可有效抑制MELK活性及其底物类脑发育调节蛋白(DBNL)和蛋白酶体亚基α1的磷酸化，降低癌细胞的侵袭性和干性[20]。Ren等[12]在头颈部鳞癌(HNSCC)中发现，OTSSP 167可下调HNSCC细胞的SOX2表达靶向癌症干细胞，影响癌细胞干性和致瘤性。基于结构的虚拟筛选：Zhou等[27]从Vitas-M化学数据库中筛选出对MELK抑制作用最强的化合物16可有效阻止FAK磷酸化，抑制SGC7901细胞迁移和侵袭。脱靶/交叉筛选：Edupuganti等[28]从已知激酶抑制剂文库中筛选出最有效的MELK抑制药物Nintedanib，在其5位上添加甲酯提高对MELK效能和选择性，形成一种最有效的针对MELK催化域的吲哚酮抑制剂——IN17[29]，可抑制HCC70细胞Mcl-1的表达，优先抑制MELK高表达TNBC细胞增殖。中医中药：血根碱在结肠癌HCT116细胞中下调和解离STRAP和MELK，激活Bax诱导凋亡，抑制增殖[18]。

2.2.2MELK与肿瘤治疗耐受：MELK在mRNA和蛋白质水平的高表达与肿瘤细胞的抗辐射性和化学耐药性显著相关[10,26]。MELK的抑制可削弱肿瘤生长，提高放射治疗和化学治疗敏感性。在神经母细胞瘤中，OTSSP 167抑制MELK及其靶基因EZH2的表达，抑制放射治疗和化学治疗诱导的折叠复制叉的形成，提高细胞对喜树碱或放射线的敏感性[21]。在乳腺癌中，MELK敲低或OTSSP 167显著延迟放射治疗后dsDNA断裂的修复，增强放射敏感性[26]。在胃癌中，MELK敲低诱导氟尿嘧啶处理后的NCI-N87细胞凋亡，增加氟尿嘧啶敏感性[10]。

3 MELK在妇科肿瘤中研究进展

3.1MELK与宫颈癌 MELK促进宫颈癌发生和进展，经免疫组织化学(IHC)测定显示，从正常宫颈、宫颈上皮内瘤变(CIN)到宫颈癌，MELK的表达率逐渐升高[13]。经实时荧光定量聚合酶链反应(qPCR)检测发现，宫颈癌或宫颈癌和CINⅢ组织中的MELK mRNA表达显著高于正常组织[13，24，30]。经qPCR和蛋白质印迹(WB)检测表明，宫颈癌SiHa、HeLa、C33A和CasKi细胞系中的MELK mRNA和蛋白表达水平均被上调[13]。

MELK促进宫颈癌增殖生长和早期转移。通过细胞计数试剂盒(CCK)-8和集落形成实验发现，MELK敲低抑制C33A和CasKi细胞增殖及C33A和HeLa细胞集落形成能力[13]。通过WB检测显示，MELK敲低显著上调C33A细胞P53和Caspase-3表达，诱导凋亡[13]。通过IHC测定表明，MELK的高表达与宫颈癌的早期转移显著相关，有淋巴或血管转移的Ⅱa期宫颈癌患者MELK的高表达率显著高于无转移者[13]。

MELK通过分子靶向干预、免疫疗法和联合疗法参与宫颈癌治疗，目前正处于临床前研究和Ⅰ期临床试验阶段[13，31-32]。分子靶向干预：OTSSP 167可抑制宫颈癌细胞增殖生长，加剧DNA损伤，诱发凋亡。经OTSSP 167处理后，通过集落形成试验发现C33A和HeLa细胞集落形成和致癌性生长能力降低，通过CCK-8和WB检测发现C33A、SiHa和HeLa细胞的增殖抑制率，C33A细胞中DNA破坏点标记蛋白γ-H2AX和裂解Caspase-3的表达随着OTSSP 167浓度的升高而升高[13]。癌症免疫肽疫苗疗法[31]：铂类耐药的人类白细胞抗原(HLA-A)单倍型2402的宫颈癌患者接种含MELK、FOXM1、HJURP、VEGFR-1、VEGFR-2的5肽疫苗的Ⅰ期剂量递增试验发现，患者进行疫苗接种是安全的，该疫苗可与MHC-1结合，在78%和89%的患者中观察到强烈的抗MELK和FOXM1的特异性细胞毒性CD8+ T淋巴细胞反应。MELK和FOXM1是高度免疫原性抗原，是宫颈癌患者免疫治疗的有希望的靶标。联合疗法：Budczies等[32]在宫颈癌组织癌症基因组图谱(TCGA)数据集中检测到涉及程序性死亡受体-配体1(PD-L1)的9p染色体上的复发拷贝数增加和MELK mRNA表达显著上调，并与免疫过程显著相关，故有必要进一步研究MELK免疫疗法联合PD-L1阻断剂治疗宫颈癌的效果。

MELK可能通过调节化学治疗药物敏感性参与宫颈癌治疗耐受过程。MELK敲低可通过同源重组途径加剧C33A细胞DNA损伤，诱导凋亡，提高顺铂敏感性。经MELK敲低联合顺铂1 μg/ml处理C33A细胞后，与单独使用顺铂相比，γ-H2AX和Caspase-3表达显著上调，DNA损伤同源重组修复蛋白Mre11和Rad 50的表达显著下调[13]。

MELK主要影响宫颈癌患者治疗后的疾病状态和生存时间。根据RECISTv1.1标准监测患者接种包含MELK的5肽疫苗后的临床反应发现，66.7%患者在3.0～10.3个月达到了疾病稳定状态，89.0%患者的中位无进展生存期为3.3个月[31]。

3.2MELK与卵巢癌 MELK促进卵巢癌发生和进展，GEO数据库9个数据集分析显示，MELK表达从浆液性良性肿瘤、交界性肿瘤到卵巢癌逐渐上调，浆液性良性肿瘤中MELK表达显著高于正常组织[33]。TCGA数据集分析显示，MELK表达随着卵巢癌组织学分级的升高和病理分化程度的降低而上调[33]。qPCR检测发现，卵巢肿瘤组织中MELK mRNA表达显著高于正常样品[24]。WB检测发现，MELK表达在上皮性卵巢癌SKOV3、OVCAR8、IGROV1、OVCAR4细胞系中最高，在正常卵巢细胞中几乎检测不到[33]。

MELK促进卵巢癌细胞致癌性生长和增殖。MELK敲低抑制卵巢癌OVCAR8细胞系集落形成和致癌性生长，诱导细胞凋亡，抑制增殖。经集落形成实验表明，MELK敲低抑制软琼脂中的OVCAR8细胞系集落形成和致癌性生长。经WB检测显示，在MELK敲低的OVCAR8细胞中存在明显的多聚二磷酸腺苷核糖聚合酶 (PARP)-1裂解，诱导凋亡，抑制增殖[33]。

MELK通过小分子抑制剂靶向干预和联合治疗参与卵巢癌治疗。小分子抑制剂：①OTSSP 167：OTSSP 167诱导G2/M期停滞抑制卵巢癌细胞增殖、集落形成和锚定依赖性和非依赖性生长，诱导细胞凋亡。通过流式细胞术分析发现，OTSSP 167处理后BG1和OVCAR8细胞的细胞核更大，可诱导明显的G2/M过渡期转换停滞，抑制增殖。通过3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)分析显示，OTSSP 167抑制卵巢癌细胞增殖的效率是正常细胞的3倍。集落形成实验表明，OTSSP 167抑制软琼脂上SKOV3、OVCAR8、OVCAR5细胞的锚定非依赖性生长和SKOV3、OVCAR8、OVCAR5、OVCAR4细胞的锚定依赖性生长。WB检测显示，经OTSSP 167处理的卵巢癌细胞系存在明显的PARP-1裂解，诱导凋亡[33]。②Nintedanib：Edupuganti等[28]进行脱靶/交叉筛选出最有效的MELK抑制药物Nintedanib。Nintedanib在卵巢癌中的应用目前正处于临床试验阶段，且多联合其他疗法使用[34-35]。Nintedanib在卵巢癌早期临床试验中具有较好的活性和安全性，在术后进展风险低的卵巢癌患者中的疗效显著，无进展生存期延长了7个月[35]。联合治疗：①OTSSP 167联合化学治疗药物：MTT分析表明，在OVCAR8细胞中，OTSSP 167联合卡铂比单用卡铂具有更高的疗效和细胞毒性[33]。②免疫疗法联合PD-L1阻断剂：在卵巢癌组织TCGA数据集[32]中检测到涉及PD-L1的9p染色体上的复发拷贝数增加和MELK mRNA表达的显著上调，并与免疫系统的热微环境吸引效应细胞显著相关，一旦PD-L1检查点封锁到位，该效应细胞就可以消除肿瘤细胞，故有必要进一步研究MELK免疫疗法联合PD-L1阻断剂在卵巢癌中的疗效。MELK抑制剂OTSSP 167可增强化学治疗敏感性逆转卵巢癌化学治疗耐药。OTSSP 167增强OVCAR 8细胞对卡铂的敏感性，MTT分析表明，OTSSP 167联合卡铂比单用卡铂更有效[33]。OTSSP 167在耐顺铂和紫杉醇的卵巢癌细胞中保留了其细胞毒性和有效性，MTT分析表明，耐顺铂的TYK-nu(R)细胞和耐紫杉醇的IGROV1-PXL细胞对OTSSP 167的敏感性显著高于其亲代细胞。OTSSP 167在抗药性卵巢癌细胞系中仍然有效且不产生卡铂、紫杉醇或阿霉素的交叉耐药，是抗药性卵巢癌治疗的重要制剂[33]。

MELK主要影响卵巢癌患者治疗后的生存时间。TCGA数据库卵巢癌患者生存分析表明，上皮性卵巢癌中MELK高表达与较短的无进展生存期显著相关，提示预后不良[33]。

综上所述，MELK可直接结合和底物磷酸化靶蛋白参与调控多种生物过程，促进妇科恶性肿瘤的形成和进展，参与其综合治疗、治疗后耐受和预后评估等过程，是一种重要的癌症驱动基因，有望成为宫颈癌和卵巢癌分子治疗的靶标和预后监测的标志物。然而，MELK的功能及其在妇科恶性肿瘤中的分子机制仍未完全阐明，MELK靶标抑制剂目前正处于临床前和临床试验阶段，仍未得到美国食品药品监督管理局批准应用，且存在脱靶、特异性争议[9]和缺乏大样本临床数据支持等问题。因此，应进一步深化MELK及其抑制剂在妇科恶性肿瘤中的功能、作用机制和调控途径的认识，进一步优化升级和合理使用现有精准医疗技术工具，进一步探讨如何构建和使用最有效的特异性最高的MELK靶向制剂，从而为妇科恶性肿瘤的临床监测、精准诊治和预后判定提供重要思路。