植物组培内生菌污染的防治措施

温璐华，武瑞娜

(河北富硕农业科技发展有限公司，河北 邢台 054499)

植物内生菌是指在其一生或一生中的某个阶段能进入活体植物组织内，并且不引起明显组织变化的真菌或细菌[1]，主要包括内生细菌、内生真菌和内生放线菌[2]。植物内生菌是一个生态学概念，而非分类学单位[3]。内生菌普遍存在于植物组织中，且难以用常规方法彻底消灭。当植物组织进行离体培养时，这些内生菌就容易引起污染。Leifert[4]等认为在正常的灭菌条件下，由内生菌产生的污染占所有污染源的1/4。污染发生在培养过程早期，往往导致增殖效率降低，材料生长减缓，玻璃化苗增加，甚至培养失败。发生在后期会导致组培苗移栽困难和死亡。此外，污染还会引起培养材料的遗传物质变异[5]。

1 植物内生菌污染特性

1.1 内生菌污染与表面菌污染的区别

内生菌存在于植物细胞内或细胞间，在外植体接种后的前几代培养中不易被肉眼察觉[6]。初代培养中，表面细菌引起的污染通常出现在接种后2～3d，表现为外植体周围或培养基表面产生明显的诸如水污状、油污状、气泡，或干缩的呈现红、黄、乳白等颜色的菌落。接种后3～5d内无症状，之后的培养过程中不断出现菌落，就可能是由内生菌引起的[7]。汤雪燕[8]等认为，内生菌造成的污染发生在接种5d以后，且污染菌从培养基以上部分长起。

1.2 常见内生菌污染种类

内生细菌不能被一般的表面消毒方法所清除，随材料带入培养过程引起的污染，称为内生细菌污染[7]。方丽[9]等发现组培中细菌污染占52.13%，分属于9个种，主要有芽孢杆菌属(Bacillus)和假单胞菌属(Pseudomonas)；真菌污染占43.87%，分属于18个种，其中芽枝霉(Cladosporiumspp.)、黑曲霉(Aspergillusniger)、青霉(Penicillumspp.)和酵母为主要污染真菌。沈瑞清[10]等发现污染马铃薯组培苗的真菌分属6属，至少12种，分别为镰刀菌属的5个种，毛霉菌属的2个种，链格孢属的2个种等。

目前，被鉴定的组培污染内生细菌主要有芽孢杆菌属(Bacillus)[11]、土壤杆菌属(Agrobacterium)[12]、葡萄球菌属(Staphylococcus)[13]、链格孢属(Alternaria)和镰刀菌属(Fusarium)[14]等。

1.3 植物内生菌的分布规律

内生菌的分布规律取决于宿主本身及内生菌的种类。在不同宿主，以及同一宿主的不同器官的分布均存在着差异[15]。此外，还受植物的种类、环境和气候等因素的影响。通常多年生材料携带的细菌数较多；田间取得的材料细菌数较温室内材料多；温室材料携带的细菌数较水培材料多；未经阳光照射过的材料，较经过阳光照射的材料多。[16]选取极幼嫩的胚或幼嫩茎尖等带菌量较少的材料作为外植体，可减少内生菌污染。

2 组培内生菌污染的预防措施

通过外植体选择、材料预处理、组培环境的控制，以及杀菌剂、抗生素的使用等措施，能够有效降低内生菌污染率。

2.1 外植体选择

生长在土壤中的块根、块茎和鳞茎，带菌量多。表面积相对较大的材料，带菌量也较多。故应尽量选择幼嫩的茎尖、胚，并选择清洁环境下的植物材料作为外植体。

2.2 材料预处理

2.2.1 采用栽培手段降低材料带菌量 减少外植体带菌量的栽培手段主要包括促发新枝、暗培养和水培等。侯喜林[17]发现在黑暗条件下黄化培养仙客来实生苗，能够消除内生菌污染。

2.2.2 用杀菌剂或抗生素对母株进行预处理 采用杀菌剂或抗生素对母株进行连续多日消毒处理，可降低带菌量。例如，每2～3天喷洒1次消毒液，浓度不宜过高，半个月到1个月之后，可以有效控制母株的内生菌量[18]。同时，为防止内生菌产生耐药性，抗生素和杀菌剂应复合使用。

2.2.3 其他方法 采用特殊的灭菌方法。周俊辉[19]等利用减压方法，抽去植物组织中的气体，使消毒剂更易进入组织内部，增强杀菌效果，污染率相比对照降低43.3%。

采用热击处理。宋艳祥[20]等发现对桉树组培苗采用40 ℃热击处理可有效降低内生菌污染率。崔巍[21]等发现，对毛尖紫萼藓进行40 ℃分段水浴并结合升汞溶液浸泡能够有效降低污染，但材料接种后全部死亡。因此，不同外植体材料在采用热击消毒方法时，需要通过试验获得具体的处理温度和时间。

2.3 改变培养基条件

2.3.1 培养基中添加抑菌剂 在培养基中添加抗生素能够有效防止细菌污染的发生。黄俊轩[22]等在北美海棠培养基中添加羧苄青霉素(250mgL-1)+卡那霉素(50mgL-1)，获得良好的脱菌效果。田永亮[23]等发现在葡萄培养基中添加40mgL-1四环素，能够有效抑制内生菌的滋生，且其对不同葡萄品种的抑菌效果不同。李凤飞[24]等在榆叶梅培养基中混合添加青霉素钠300mgL-1、链霉素100mgL-1，获得相对较低的污染率。

在培养基中添加杀菌剂，能够减少内生真菌污染的发生。许婉芳[25]等研究发现，在金线莲培养基中加入50%多菌灵，抑菌率达100%。李海峰[26]等研究发现，培养基中添加0.5～1.0mgL-1培福朗能够有效控制莲瓣兰胚培养过程中的真菌污染。张立[27]等研究发现采用浓度80%多福锌可湿性粉剂800倍液的培养基对降低污染率有良好效果。

2.3.2 调节培养基成分 内生菌生长需要一定的营养条件，通过增加或去除、提高或降低培养基中的某种成分的浓度(盐分、糖分或者单宁酸等)，创造不适宜的生长环境，使其无法继续发育而死亡。宋锋惠[28]等研究发现，除去阿月浑子培养基中的VB1、VB6、烟酸等有机成分(保留肌醇)，对细菌生长有抑制作用，且不影响材料生长增殖。

2.3.3 调节培养基的pHpH值对细菌和真菌细胞内酶的活力、细胞膜的通透性、细胞内外物质的运输和细胞呼吸等均有很大影响。除欧文氏菌属之外，大多数细菌在pH<4.5环境下不能生长。因此，可以通过适当调节培养基的pH，来避免大量的细菌污染产生。

3 污染发生后的补救措施

3.1 抗生素在组培细菌污染中的应用

细菌污染通常表现为：菌落分布在培养基表面，呈现黏液状或浑浊的水渍状，甚至出现泡沫发酵状，其中以芽孢杆菌引发的污染最为普遍和严重，菌落乳白色，呈滴形云雾状[29]。

黄俊轩[22]等以北美海棠为试材，在MS培养基中添加250mgL-1羧苄青霉素和50mgL-1卡那霉素，连续3次继代培养，能够获得生长稳定的脱菌苗。王梅[30]等研究发现青霉素G浓度为400mgL-1，能够有效控制‘章姬’草莓苗内生菌污染。而李颖[31]等以银白杨、四倍体刺槐、微型月季和地被菊为材料研究发现，青霉素对细菌污染只起到一定抑制作用，并不能杀灭细菌。

不适宜的抗生素种类对组培苗生长具有负面作用。任艳[32]等研究发现，羧卞青霉素对花生组培苗的生长有负面影响。蔡坤秀[33]等研究发现，卡那霉素和链霉素对芦笋的生长有明显的毒害作用。阎志红[34]等研究发现，培养基中分别添加青霉素或乳酸，培养数代后西瓜组培苗生长生根受到明显抑制，二者交替使用，能够降低其对生长的抑制作用。

针对不同内生细菌污染需要根据细菌的种类选择适宜的抗生素，并通过试验确定最小使用浓度，避免抗生素因遇酸、碱或加热后分解而失去活性，并寻找稳定、耐高温高压的抑菌剂。

3.2 杀菌剂在组培真菌污染中的应用

组培真菌污染通常表现为培养容器内出现白色、黑色、绿色等不同颜色的菌丝块，其中最为常见的是曲霉、毛霉和青霉属真菌[35]。

常用的杀菌剂有多菌灵、代森锰锌、百菌清等。李颖[31]等研究发现，采用3 %多菌灵无菌液浸泡被真菌污染的材料0.5h以上之后接种，能够消除真菌污染。李云海[36]等研究发现，培养基加入75%代森锰锌对莲瓣兰等地生兰的组织培养过程中出现的真菌污染具有显著的防治效果。赵双双[37]等研究发现，在种子萌发阶段使用含0.05%多菌灵的培养基，幼苗生长阶段使用含0.05%百菌清的培养基，可明显抑制组培污染。方丽[38]等研究发现，乙蒜素和链土霉素对组培细菌和真菌有良好的杀灭效果，且乙蒜素耐高温，可以在配制培养基时直接添加。

3.3 其他药剂的使用

其他药剂包括防腐剂、乙醇、升汞和一些植物提取物等。李颖[31]等研究发现，采用75%乙醇和0.1%HgCl2处理可以彻底杀灭真菌和细菌。周蒋陈[39]等研究发现，培养基中添加防腐剂苯甲酸钠和山梨酸钾，能够抑制鸢尾组培内生菌的滋生，且耐高温高压，但苯甲酸钠的使用浓度不应超过0.5%，否则会影响组培苗的增殖率。李白[40]等研究发现生姜、洋葱、大蒜和苦瓜的食用器官的粗提物对分离的组培污染细菌有一定的抑制效果，且与抗生素相比，植物源抑菌剂具有低毒、低残留、对组培苗伤害小等优势。