Gene Xpert-MTB/RIF法快速诊断脊柱分枝杆菌及利福平耐受性的临床应用研究

姚海山，卢炯炯，郭 鑫，沈生军*

（青海大学附属医院，青海 西宁 810000）

结核病是发展中国家最常见和最具挑战性的疾病之一，我国是结核病的高发国家，同时也是耐多药结核的高负担国家。根据全球结核病报告，肺外结核病约占所有结核病的20%，其中脊柱结核是最常见的肌肉骨骼结核。脊柱结核发病隐匿，早期无典型临床表现，且病灶位于椎体等深部组织，临床标本不易获得。因此，脊柱结核诊断较为困难。当大部分患者确诊时，已存在明显的脊柱骨质破坏，并且常伴有神经功能的损伤。所以脊柱结核的早期诊断及规范化治疗有着重要意义。在已有的临床诊断技术中，传统显微镜检查阳性率低，细菌培养时效性差，影像学表现特异度较低等诸多问题，延长了诊断时间，延缓了治疗进展。

1 Xpert-MTB/RIF技术的基本情况

Xpert-MTB/RIF技术是一种利用GeneXpert平台（Cepheid, Sunnyvale, CA, United States）进行的自动聚合酶链反应（PCR）测试（即分子测试）。能够检测结核分枝杆菌和利福平耐药性，是一种简便、快捷的实践技术。Xpert-MTB/RIF技术利用分子信标技术检测利福平耐药性，分子信标是一种核酸探针，可以识别和报告正常的、利福平易感的野生型rpoB基因序列的存在或缺失。使用了5个不同颜色的信标，每个信标在扩增的rpoB基因中覆盖一个单独的核酸序列。当信标与匹配序列结合时，它会发出荧光（或点亮），这表明存在利福平敏感结核病特有的基因序列之一。

Xpert-MTB/RIF技术的操作流程简单方便，实验室将接收的组织样本用无菌研磨机在1～2毫升无菌生理盐水中研磨，获得质地均匀的悬浊液，再用NaLC-NaOH对材料进行去污。用无菌移液管吸取2 ml的样本液体后，缓慢加入检测盒的加样孔中后，最后将检测盒放入Xpert-MTB/RIF仪器中检测。整个检测流程约需2小时左右。与传统的核酸扩增检测（NAATs）相比，结核分枝杆菌样品处理、PCR扩增和检测集成到一个自成一体的测试单元。取样后，所有的步骤都是自动化的，并包含在墨盒中。此外，用于溶解样本的试剂是结核性的（也就是说，它有杀死结核细菌的能力），这在很大程度上消除了实验过程中对生物安全的担忧。这些特点使得该技术可以从中心实验室或参考实验室中取出，并在离病人更近的地方使用。

2 Xpert-MTB/RIF在脊柱结核中的发展情况

2010年9月，世界卫生组织（世卫组织）召集了一个专家小组，审查关于Xpert-MTB/RIF测定（美国加利福尼亚州森尼韦尔市Cepheid）准确性的证据，目的是制定指导该试验使用的建议。自2010年以来出现了大量关于Xpert-MTB/RIF技术的应用数据，有必要更新世卫组织的政策和指导。因此，世卫组织全球结核病规划委托进行了三次系统审查，以更新和修订指南。世卫组织于2011年初发布了关于使用Xpert-MTB/RIF技术的政策建议，推荐Xpert-MTB/RIF应作为对怀疑患有MDR-TB或HIV相关结核病的患者的初步诊断试验和Xpert-MTB/RIF可被视为在MDR-TB或HIV不太受关注的环境下对显微镜的后续检测，特别是在进一步检测涂片阴性标本时。在2013年世卫组织再次推荐使用Xpert-MTB/RIF技术诊断成人和儿童肺结核和利福平耐药和Xpert-MTB/RIF技术用于诊断成人和儿童肺外结核及利福平耐药。在我国Xpert-MTB/RIF技术较广泛应用于肺结核诊疗。目前，在脊柱结核这一方面的研究，我国处于初级研究阶段。

3 Xpert-MTB/RIF法诊断技术应用价值

Xpert-MTB/RIF法检测结核分枝杆菌131个菌落形成单位（cfu/ml），比分枝杆菌培养法检测100～1000 cfu/ml更为有效，且Xpert-MTB/RIF法检测取决于标本中MTBDNA的含量，并非培养法检测依靠活菌计数。早期发现结核分枝杆菌有助于迅速开展适当的抗结核治疗；利福平是否耐受有助于调整用药。Liang Tang等根据术中获取的脊柱结核病灶，特意将病灶分类为三组不同成分单一组织，其为脓液、肉芽肿组织及干酪样组织。分组后进行检测脊柱脊柱分枝杆菌。结论认为获得脓液成分的标本，可确保使用Xpert-MTB/RIF法更方便、快速、准确地诊断结核分枝杆菌。Lin QX等对43名经病理证实患有晚期关节结核的患者进行了基于PCR的荧光检测。结果发现，肉芽组织的阳性率高达74.42%，与干酪样组织（58.14%）和脓液（37.21%）。与Liang Tang等研究相似，说明在不同部位的标本中MTB-DNA含量差异较大，故Xpert-MTB/RIF法并非仅对脓液标本有着较高的辨识度，而需要根据不同部位的标本具体分析，而当前国内外缺乏这一方面的研究。Arockiaraj J等印度南部使用Xpert-MTB/RIF法回顾性研究中，以复合参考为参考标准，Xpert-MTB/RIF法敏感性和特异性分别为71.2%和100%。饶敬澄等人同以复合参考为金标准，其敏感性和特异性分别为74.4%和100%。可见Xpert-MTB/RIF在诊断脊柱结核分枝杆菌有很高的特异性与敏感性。贾晨光等人经研究，抗酸染色、BACTEC MGIT 960液体快速培养、Xpert-MTB/RIF检测脊柱结核分枝杆菌的敏感度分别为38.35%、41.67%、79.76%，特异度分别为100.00%、100.00%、96.87%。金阳辉等研究所得，抗酸染色、BACTEC MGIT 960液体快速培养及Xpert-MTB/RIF检测的总体敏感性分别为25.92%、48.15%和77.78%。特异度分别为100.00%、100.00%、96.87%。二者研究共同点在Xpert-MTB/RIF法比抗酸染色、BACTEC MGIT 960液体快速培养灵敏性更高，特异性均大于96%。而且抗酸染色及液体培养过程缓慢及敏感性低，所以Xpert-MTB/RIF法更适用早期诊断脊柱结核分枝杆菌。金阳辉等研究还提到不同操作方法获得结核病灶后，用Xpert-MTB/RIF法检测结核分枝杆菌的敏感性由高到低依次为开放手术（83.78%）、B超穿刺（76.47%）、椎体穿刺（44.68%）。开放手术、B超穿刺与椎体穿刺组间差异有统计学意义（P＜0.05）；与Liang Tang等的结果相同，开放手术更利于获得脓液、肉芽组织等有效成分。

综上所述，通过Xpert-MTB/RIF系统检测脊柱结核分枝杆菌及对利福平药物耐受性方面是切实可行的，并且在检测速度、灵敏性、特异性、生物安全性等多方面均显示优势。虽然Xpert-MTB/RIF系统目前在我国脊柱结核方面的研究尚处于发展阶段，但是，它的巨大潜力正推动这一领域逐渐获得更多的关注。