幽门螺杆菌与食管鳞状细胞癌相关性研究进展

庄铭泉，肖沁阳，林 琳

(1.厦门医学院 临床医学系，福建 厦门 361023；2.厦门医学院 基础医学部，福建 厦门 361023)

幽门螺杆菌(Helicobacterpylori, Hp)是一种主要在胃定植的革兰阴性菌，由澳大利亚B.Marshall于1982年首次分离和发现，目前被认为是消化性溃疡病的主要原因[1]，1994年国际癌症研究中心(IARC)将Hp列为Ⅰ类致癌因子。目前已有的数据显示全球成人Hp感染率范围为28.3%～93.6%，我国成人感染率为63.4%[2]。Hp可产生大量的尿素酶，尿素酶不仅可水解尿素成NH3以中和胃酸，还具有抗氧化作用，二者皆有助于Hp在胃腔生存[3]。Hp能产生细胞毒素相关蛋白A(CagA)和空泡毒素A(VacA)。CagA通过加剧炎症，与Src同源磷酸酪氨酸磷酸酶2(Src-homology 2 domain-containing protein tyrosine phosphatase, SHP2)结合等途径参与肿瘤的转化[4]。早期研究即发现VacA除了能使细胞空泡化还与细胞凋亡有关，但其诱导凋亡的确切机制尚不清楚，推测可能与VacA定位于线粒体有关[5]。新近一项研究表明VacA通过内质网应激途径诱导胃上皮细胞自噬性细胞死亡[6]。Hp通过产生上述致病物质，引起组织损伤而导致消化性溃疡，引起慢性炎症和肿瘤的转化而与胃癌息息相关。除此之外，最近Hp还被发现可能与许多胃外疾病，如阿尔茨海默病、格林-巴利综合征、酒渣鼻、开角型青光眼等有关联[7]。

根据世界卫生组织《2014年世界癌症报告》，全球食管癌发病率在恶性肿瘤中居第8位，死亡率居第6位。食管癌最主要的病理类型为食管鳞状细胞癌(esophageal squamous cell carcinoma, ESCC)和食管腺癌(esophageal adenocarcinoma, EAC)。其中ESCC在全球的发病率为5.2/10万，男女发病率比值约为2.7，中国的发病率占全球的53%[8]。目前认为ESCC可能的危险因素包括：酒精、烟草、槟榔、热饮、微量元素硒的缺乏、接触多环芳烃(PAH)、口腔卫生不良/牙齿缺失、与反刍动物长时间密切接触、口腔微生物等[9]。近年越来越多的研究关注Hp与ESCC的相关性，我们使用关键词“Helicobacterpylori”、“esophageal squamous cell carcinoma”在PubMed上搜索，共获得近20年来的相关文献90篇。其中非综述类、非Meta分析类且在结论中明确阐述二者“相关”或“不相关”的文献共15篇，包括8篇研究结果提示Hp感染与患ESCC的风险呈负相关[10-17]，4篇研究则认为二者呈现正相关关系[18-21]，以及3篇研究未发现Hp感染与ESCC相关[22-24]。本文就Hp与ESCC相关性研究进展进行综述，并对导致争议性研究结果的原因进行分析。

1 导致Hp感染与ESCC相关性争议的可能原因

1.1 Hp检测方法差异

目前尚无公认的Hp检测方法金标准[25-26]，我国目前关于Hp感染的诊断是依据以下共识——符合下述3项之一者可判断为Hp现症感染：(1)胃黏膜组织快速脲酶实验(rapid urease test, RUT)、组织切片染色或培养3项中任一项阳性；(2)尿素呼气试验(13C或14C-UBT)阳性；(3)粪便Hp抗原(Hp stool antigen, HpSA)检测(经过临床验证的单克隆抗体法)阳性。血清Hp抗体检测(经临床验证、准确性高的试剂)阳性提示曾经感染，从未治疗者可视为现症感染[27]。2017年《第五次全国幽门螺杆菌感染处理共识报告》推荐UBT为首选的非侵入性Hp检测方法，推荐RUT为首选的侵入性检测方法[28]。上述15项研究中，除去2项体外研究实验[12, 21]，共有13项研究进行了人体Hp感染的检测，在这些研究中涉及的检测方法主要有3类。

一类是RUT检测：如Poyrazoglu OB等[16]用Hp快速检测商业试剂盒(GI Supply, Camp Hill, PA, USA)检测胃活检标本中的脲酶活性。Chuang YS等[17]采用RUT、UBT或活检对Hp感染进行诊断，但其并未在文章中指明所选用试剂等详细信息。

一类是通过血清学试验检测Ab判断Hp感染：Henrik Siman J等[10]用超声法从参考菌株CCUG17874制备抗原，采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测血液样本中抗-Hp IgG，以吸光度值≥0.700判定为Hp感染阳性。Ye W等[18]用ELISA商业试剂盒(Pyloriset EIA-G; Orion Diagnostica, Espoo, Finland)检测血清抗Hp细胞表面抗原(Hp-CSAs)的抗体，用免疫印迹法商业试剂盒(Helicoblot 2.1; Genelabs Diagnostics, Singapore)检测CagA抗体。Wu DC、Hu HM和Wu IC等[11,13-14]采用ELISA(ChembioH.pyloriSTAT-PAK, Chembio Diagnostic System, Inc., Medford, NY, USA)检测Hp IgG阳性率。Kamangar F等[22]用ELISA检测血清中抗全细胞(whole-cell, WC)和抗CagA抗原的IgG，以血清WC抗体吸光度≥1.0或CagA抗体吸光度≥0.35判定为Hp感染阳性，若两种抗体均阴性判定为Hp感染阴性。采用相同判定方法的还有Cook MB等[23]。Khoshbaten M等[15]在离心后，用ELISA商业试剂盒(ELISA, PatanTeb, Iran)测定血清中抗Hp-CSAs的IgG。Wang Z等[19]未在文章中说明血清学检测Hp的方法及相关标志物。

还有一些研究者使用组织学检测法：Li WS等[20]对ESCC标本进行染色后，定义Giemsa染色(4 μm切片)和免疫组化(4 μm切片，Hp多抗和HRP标记的兔IgG抗体购自Invitrogen, Santa Cruz, California, USA)皆阳性者判定为Hp感染。Venerito M等[24]同时使用了3种方法，用ELISA商业试剂盒(Pyloriset EIA-G Ⅲ; Orion Diagnostica, Finland)检测抗-Hp IgG，用免疫印迹法商业试剂盒(Viramed Biotech AG, Lich, Germany)检测CagA抗体，对活检组织进行HE染色，并定义组织学检测阳性、RUT阳性、血清学检测阳性(抗-Hp IgG和CagA抗体皆阳性)三者中至少满足一项即为Hp感染，但其未在文章中说明关于RUT和组织学检测的其他相关信息。

前述3种方法中，血清学检测为非侵入性试验，费用较低，血清学结果不受抑酸治疗、近期抗生素使用影响，不受Hp胃内分布不均的影响，使其相比其它组织样本检测更具一致性。然而，血清学阳性并不能反映Hp现症感染(抗体持续存在通常超过半年)。组织学检测和RUT皆属侵入性试验。成本高、病理学家检查的可变性以及人员的培训都是组织学检测的限制因素[29]。RUT检测结果受试剂pH值、取材部位、组织大小、细菌量、观察时间、环境温度等因素影响[27]。因此，不同的检测方法具有不同的敏感性和特异性，导致Hp阳性检出率不同，并且可出现假阴性及假阳性。国外有学者研究表明：血清学检测的敏感性和特异性分别为85%和79%，组织学检测的敏感性和特异性分别为66%～100%和94%～100%，RUT的敏感性和特异性分别为75%～100%和84%～100%，HpSA检测的敏感性和特异性分别为67%～100%和61%～100%，UBT的敏感性和特异性分别为75%～100%和77%～100%，PCR的敏感性和特异性分别为75%～100%和84%～100%，细菌培养的敏感性和特异性分别为55%～56%和100%，该学者认为PCR略优于其他检测方法[25]，结合两种或两种以上的检测方法有助于获得更准确的结果[25, 30]。

如前所述，Hp检测方法的差异可导致Hp检测结果的不同。Eross B等[31]在Barrett食管与Hp感染相关性的Meta分析中发现，Hp检测方法(胃组织学检测、食管组织学检测、血清学检测、快速脲酶试验)的不同对二者相关性有不同的影响，此外他们还发现除了血清学检测无明显异质性，其他检查的异质性都很高，提示Hp检测方法的差异性可能是导致Hp与ESCC相关性存在差异的原因之一。

总之，各项研究间的检测方法不统一，使得Hp的检出存在误差，可能引起实验结果的差异。

1.2 人群异质性

在所获文献中，针对不同地区的研究结果不同。例如台湾地区的研究普遍都认为Hp与ESCC呈负相关[12, 14, 17]，而大陆的两项研究则支持二者呈正相关关系[19-20]。Xie FJ等[32]的Meta分析发现在东方人群中，Hp感染与ESCC风险降低之间存在显著的关联，而在西方研究对象中发现Hp感染与ESCC风险之间没有显著的相关性。另一项Meta分析发现在亚洲人群中CagA阳性Hp菌株与ESCC呈负相关关系，但在非亚洲人群中，二者呈正相关关系[33]。在不同地区得到不同的研究结果提示了人群异质性对于Hp与ESCC相关性是一大影响因素。

人群异质性包括了人群的遗传学因素、生活方式、饮食习惯、肠道菌群构成以及癌细胞分子靶点差异等，对于ESCC的发生可能起促进或抑制作用。例如嗜酒、喜食槟榔、喜热饮等的人群ESCC的患病风险相对较高[9]，此外，研究发现食用富含多酚的食物如苹果、蓝莓等可以显著降低癌症的发病率[34]，提示了喜食某些特定的食物或可影响ESCC的患病风险。 Jia N等[35]比较了家族史阳性和阴性的ESCC患者，发现阳性组患者多原发癌发生率显著高于阴性组，且阳性组患者发病年龄更早，进一步分析提示其中的ESCC发病年龄更早是环境和遗传危险因素共同作用所致，而多原发癌仅仅与遗传倾向关联。随后Bhat GA和Chen T等[36-37]的研究也发现有ESCC家族史的个体患病风险显著升高，支持遗传因素参与了ESCC的发病。肠道菌群构成受年龄、饮食习惯、宿主免疫功能、宿主遗传学、抗生素的使用等影响而改变[38]，因此也参与了人群异质性的构成。已有的研究发现肠道细菌的某些代谢产物(如丁酸盐，丙酸盐，脂多糖等)作用于宿主细胞表达的分子靶点，发挥抑癌/促癌作用[39]，提示了肠道菌群或可通过代谢产物与ESCC细胞的分子靶点相互作用产生相应效应。Souza-Santos PT等[40]在新近的一项研究中通过RNA-seq分析了ESCC的完整基因组谱，发现TP53、LOC38983等基因突变频率较高，以TP53基因最高，而TP53基因突变大多数导致编码无功能的蛋白质，研究者因此认为ESCC基因组中存在的高频突变现象使ESCC患者存在高度异质性，并认为这对ESCC的靶向治疗发展有负面影响。以上研究进一步提示在不同人群中，基于遗传背景的差异、在饮食习惯等环境因素的协同作用下，分子水平的异质性使得ESCC细胞对肠道菌群作用的反应不同，而Hp与ESCC相关性研究的结果受到了多重变量的影响，然而这需要更多的研究证实。

综上，人群异质性对ESCC的患病风险造成的影响，可能掩盖了Hp与ESCC的相关关系。

1.3 Hp致病异质性

Hp致病性差异主要体现在CagA和VacA的异质性。一项以瑞典本土人群为研究对象的研究发现CagA血清阳性与ESCC的风险增加有关[18]，一项体外研究发现CagA+Hp滤液可以诱导ESCC细胞增殖[21]，这些结果均提示CagA与ESCC相关。然而关于CagA能否直接促进ESCC的发生仍需更多的研究佐证。CagA的异质性包括表达量和毒力差异。有学者发现来自东亚国家临床分离的Hp几乎都携带cag致病岛，而分离自西方国家的Hp则大约有30%～40%不携带cag致病岛[4]，虽然该文章并未给出更多详细信息，但这提示了CagA的表达存在地区性的差异。Tsukanov VV等[41]发现在Hp+的条件下，白种人的CagA血清阳性率远高于蒙古人种。提示CagA在不同人种中表达情况不同。Nie S等[33]的Meta分析中发现与CagA阴性菌株相比，CagA阳性Hp与EAC的相关性较低。这提示CagA的表达也可能影响Hp与ESCC的相关性。此外CagA毒力存在异质性，这种异质性体现在酪氨酸磷酸化基序(EPIYA)和多聚化基序(CM)上。Naito M等[42]发现CagA的EPIYA重复多态性对磷酸化依赖性CagA活性的大小和持续时间有很大影响，这可能决定单个CagA的潜在毒力。Ahire D等[43]比较了两种不同CM基序(CagA-WE和CagA-WW)的CagA对细胞功能的影响，发现CagA-WW比CagA-WE具有更强的毒性。另外，在过去人们已经认识到CagA可结合并活化SHP2，SHP2参与了生长因子/细胞因子受体下游信号的传导，能够调节细胞活动，包括增殖、形态发生和细胞运动性，进而参与胃癌、乳腺癌、口腔鳞状细胞癌等的发生与发展[44]。Hayashi T等[45]的研究发现东亚株CagA(East Asian CagA)与SHP2的结合强度比Ⅰ型西方株CagA(type Ⅰ Western CagA)强100倍(此前他们的研究已发现Ⅰ型西方株CagA与SHP2的结合强度比Ⅱ型西方株CagA(type Ⅱ Western CagA)大约强100倍[46])，并且东亚株CagA通过与N-SH2的高亲和力单价相互作用与SHP2结合，而Ⅱ型西方株CagA通过与N-SH2和C-SH2的二价相互作用与SHP2结合[45]。这提示了不同CagA与SHP2的结合强度和结合方式不同，进而导致不同的CagA可能最终产生差异化的生物学效应，对机体造成不同的危害。VacA是Hp的另一种致病物质，也具有异质性。目前研究发现所有鉴定的Hp菌株都具有VacA基因[5]，VacA基因也具有多态性，体现在信号区(s1和s2)和中间区(m1和m2)的基因结构不同，体外实验表明，s1/m1菌株的细胞毒性最强，其次是s1/m2菌株，而s2/m2菌株无细胞毒性，s2/m1菌株则十分罕见[47]。因此不同菌株的VacA的致病性不同。

不同地区、不同人群中的Hp菌株由于存在致病物质CagA和VacA的异质性，因而可能导致Hp与ESCC相关性研究结果的地区差异性。但值得注意的是，目前的Meta分析尚无讨论关于CagA和VacA的分层是否与ESCC相关，故这个推测仍需更多研究佐证。

2 Hp影响ESCC发生发展的可能机制

如前所述，目前针对Hp与ESCC相关性研究中，存在认为二者正相关、负相关、不相关三种观点。认为二者相关的不少学者对于Hp影响ESCC发生发展的机制提出自己的看法，此外，也有诸多研究的发现或可支持Hp通过多种机制影响ESCC的发生发展，但尚无明确定论。根据目前的研究认为Hp可能通过间接和直接作用影响ESCC的发生和发展，并且其作用具有两面性(既有促进又有抑制)。

2.1 Hp影响ESCC发生发展的间接途径

Hp通过影响胃酸分泌间接参与ESCC发生的“双向作用”。目前的研究发现，Hp影响胃酸分泌依赖两种途径，一是Hp通过直接接触破坏壁细胞并引起胃萎缩，二是在前述过程中上调了宿主细胞因子IL1-β和TNF-α的表达，这些细胞因子可以抑制胃酸的分泌[48]。基于胃萎缩引起胃酸分泌减少，早期学者认为Hp通过这一途径导致胃酸反流引起的食管受损几率减少，从而对食管有一定的保护作用[11]。Hp引起胃萎缩的途径除了依靠机械损伤，与CagA、VacA等也有关，Gao L等[49]的研究发现包括CagA和VacA抗体在内的15种Hp抗体的血清阳性率与慢性萎缩性胃炎显著相关，佐证了这一观点。值得注意的是胃萎缩引起的胃酸减少除了对食管的保护作用，还对胃内非Hp耐酸细菌的生长和亚硝胺的产生有促进作用[50-51]，而这些耐酸细菌来源于口腔和十二指肠，包括链球菌，奈瑟菌和乳酸杆菌等。亚硝胺已被发现是诱发ESCC的主要原因之一[52]。因此Hp引起的胃萎缩对ESCC的发生还有促进作用，这个结论也得到了Iijima K和Cook MB等研究的支持；Iijima K等[53]发现在瑞典，胃萎缩是ESCC的危险因素，Cook MB等[23]证明胃萎缩的生物标志物(PGⅠ和PGⅠ/PGⅡ比值)与ESCC的风险有关。

此外治疗Hp的药物之一奥美拉唑本身可以增加胃内亚硝胺的水平[54]。

因此，Hp一方面可能通过上述两种途径引起胃酸分泌减少而对ESCC的发生起到保护作用，另一方面又可能因为胃酸分泌减少，引起胃内非Hp细菌大量繁殖产生大量亚硝胺，或者由于服用奥美拉唑治疗引起体内亚硝胺的增多，成为ESCC的危险因素，从而表现出特殊的“双向作用”。

2.2 Hp影响ESCC发生发展的直接途径

Hp可通过多种途径促进或抑制细胞的增殖直接参与ESCC的发生和发展。过去Maeda S等[55]发现CagA+的活Hp既可以通过使Bax蛋白易位到线粒体中，进而诱导细胞色素c从线粒体释放引起癌细胞凋亡，又可以通过诱导NF-κB活化来发挥抗凋亡作用，提示Hp对于癌细胞具有双向作用。在后来的研究中，Wu IC等[12]发现Hp可以体外诱导ESCC细胞的凋亡而降低ESCC风险，Ying GX等[21]发现Hp能促进ESCC细胞的凋亡也促进了增殖，并认为增殖的细胞可以弥补细胞的凋亡，而其所依赖的机制是CagA与SHP2结合后促进细胞增殖的作用。另外也有研究发现LPS与ESCC细胞上的TLR4结合，激活ERK和p38MAPK信号通路，促进癌细胞增殖[56]，提示了Hp可利用胞壁成分LPS参与ESCC的发展。此外，一项体外研究表明lncRNA-Gas5通过抑制细胞生长，在ESCC中发挥抑癌作用，而ESCC中高表达的miR-196a可以导致lncRNA-Gas5表达下降[57]，而在之前已有研究表明Hp能够增加miR-196的表达水平[58]。这意味着Hp可以通过增加miR-196的水平来提高患ESCC的风险。

总之，Hp可能通过多种途径促进或抑制细胞的增殖而参与ESCC的发生和发展，但需要注意的是，以上研究皆是体外实验，由于Hp主要在胃定植，对ESCC的直接作用存在空间上的限制，因此Hp是否能对ESCC有直接作用仍然值得进一步研究。

3 总结与展望

目前，关于Hp与ESCC的相关性研究仍存在争议，主要原因可能与检测方法不同、人群异质性、Hp致病异质性等有关。因此，需要综合考虑上述影响因素开展深入研究，并进行多地区人群间的比较分析。关于Hp影响ESCC发病的相关机制研究仍然较少，目前认为Hp对ESCC的作用依赖于影响胃酸分泌、诱导线粒体释放细胞色素c、活化NF-κB、CagA与SHP2结合、LPS结合TLR4、增加miR-196的表达等途径，综合这些途径的作用，推测Hp对于ESCC的影响可能具有两面性(既有促进又有抑制)，而正反双方的力量对比决定着Hp对ESCC最终作用，这亦可能是二者相关性研究结果存在争议的原因之一。Hp感染人体后可通过多种机制逃脱免疫防御，包括抑制固有免疫中最重要的NK细胞的杀伤[59]。而MICA(MHC class Ⅰ related chain A)分子是活化NK细胞的关键分子。课题组早期的研究发现，肿瘤相关基因MICA多态性在不同人群中的分布存在高度异质性[60]，MICA基因多态性及血清sMICA水平与结直肠癌、结核等慢性炎性疾病的发病存在相关性[61-62]。因此，在后续工作中继续研究MICA在参与Hp感染后的免疫逃逸及其对ESCC发病的影响中的可能作用，将有助于更深入理解Hp与ESCC的关系，并且，随着研究的深入或可发现防治ESCC的新策略，特别是为实现个体化治疗提供更多的理论依据和实验支持。